Лекция 2. Хромосомный анализ и его методы Введение

До 1959-1960 гг. получение качественных препаратов хромосом для проведения цитогенетического анализа представляло существен­ную проблему, поскольку для этой цели было необходимо исследо­вать клетки тканей, обладающих высокой пролиферативной актив­ностью, например кроветворной ткани костного мозга. К началу 60-х годов XX столетия усилиями нескольких исследователей был разра­ботан достаточно эффективный метод получения препаратов хро­мосом из лейкоцитов периферической крови человека. В 1959 году Хангерфорд с соавторами (Hungerford et al.) предложили метод крат­косрочного культивирования клеток периферической крови челове­ка in vitro. В 1960 году Ноуэлл и Хангерфорд (Nowell, Hungerford) предложили применение в качестве митогена (стимулятора клеточ­ного деления) выделенный из семян фасоли мукополисахарид фи-тогемагглютинин (ФГА), позволивший индуцировать in vitro деление покоящихся Т-лимфоцитов периферической крови. В том же году Мурхед с соавторами (Moorhead et al., 1960) предложили высуши­вать на воздухе раскапанную на предметные стекла клеточную сус­пензию делящихся клеток, что привело к созданию удобного цитоге­нетического метода, пригодного для диагностических целей.

1. Методы приготовления препаратов хромосом

По мере развития цитогенетики арсенал используемых методов непрерывно пополнялся. К настоящему времени, возможно изуче­ние всего хромосомного набора, отдельных хромосом и их участков в клетках практически любых тканей и органов, на любой стадии кле­точного цикла, в митозе и мейозе.

В зависимости от степени пролиферативной активности клеток разных тканей in vivo и in vitro различают прямые и непрямые мето­ды получения препаратов хромосом.

1) Прямые методы используются при исследовании тканей, обла­дающих высокой митотической активностью (костный мозг, хори­он и плацента, клетки лимфатических узлов, ткани эмбриона на ранней стадии развития). Препараты хромосом готовятся непос­редственно из свежеполученного материала после специальной обработки.

2) Непрямые методы включают получение препаратов хромосом из любой ткани после ее предварительного культивирования в те­чение различного периода времени.

Существует множество модификаций прямого и непрямого мето­дов приготовления хромосомных препаратов, однако основные эта­пы получения метафазных пластинок остаются неизменными:

1. Использование колхицина (колцемида) - ингибитора образова­ния митотического веретена, который останавливает деление кле­ток на стадии метафазы.

2. Гипотонический шок с использованием растворов солей калия или натрия, которые вследствие разницы осмотического давления внутри и снаружи клеток вызывают их набухание и разрыв меж­хромосомных связей. Такая процедура приводит к отделению хро­мосом друг от друга, способствуя более сильному их разбросу в метафазных пластинках.

3. Фиксация клеток с использованием ледяной уксусной кислоты и этанола (метанола) в соотношении 3:1 (фиксатор Карнуа), что способствует сохранению структуры хромосом.

4. Раскапывание суспензии клеток на предметные стекла.

5. Окрашивание хромосомных препаратов.