Обробка (Finishing) 2

Щоб заповнити прогалини в послідовності, створюють праймери і послідовності праймерів

Для забезпечення адекватного охоплення, знаходять регіони, де немає достатнього охоплення та використовують специфічні праймери для тих областей

Прогалини, як правило, заповнюються послідовністю, що створюють праймери, які доповнюють один одного в регіонах, прилеглих до щілин. Реакції секвенування потім виконується з використанням цих праймерів на дані клони, що містять проблемну область ДНК в якості матриці. Подібна стратегія використовується для районів з недостатнім охопленням: Custom праймери зроблені і потім використані для спрямованого секвенування конкретного регіону.

Перевірка

Регіон перевіряють на наступне:

Покриття

Якість послідовність

Суміжність

Визначають рестрикційно-ферментне розщеплення сайтів

Створення рестрикційних карт регіону секвенування

Не можна не погодитися з фінгерпрінговим генеруванням клону під час кроку картування

На заключному етапі обробки перевіряють послідовності. Всі регіони перевіряються на ступінь охоплення (наприклад, скільки разів того ж регіону були послідовними, і в якому напрямку), якість послідовності (тобто чи було видалене повторення для всіх позицій в послідовності), і суміжність (тобто, чи послідовність утворює одну безперервну ділянку ДНК). Хорошою перевіркою якості послідовності, є , яке часто використовується в завершальній стадії, щоб визначити місце, де ферменти рестрикції б розрізали в недавно включену послідовність. Рестрикційна карта формується з послідовності, а потім порівнюється з вже відомими фінгерпрінгами, отриманими від клонів під час кроку картування. Якщо обидва показують по тій же схемі, то це вважається ознакою того, що послідовність має високу якість і відносно мало помилок.

Картування на основі секвенування 1

Проект Геному Людини запозичив стратегію основану на картуванні

Початок з чітко визначеної фізичною карти

Створення найкоротшого шляху доріжки для велико-вставочних клонів

Установлення послідовності для кожного клону

Потім збір всієї послідовності, що заснований на фізичній карті

Проект Геному Людини запозичив стратегію основану на картуванні для всіх геномів, що були розшифровані. Такий підхід, починається з чітко визначеною фізичною карти, що як правило, складається з перекриваючих BAC або PAC клонів. Серед перекриваючих клонів, ті, які утворюють те, що називається найкоротшим шляхом доріжки. Найкоротший шлях доріжки це просто набір клонів, які мають найменш перекриттів між ними. Причина використання найкоротшого шляху доріжки є те, що менше клонів, потребують бути послідовними. Кожен клон потім випадково порізаний, і послідовно прочитаний і зібраний. Збирання з послідовності кожного BAC або PAC, всю послідовність кожної хромосоми засноване на фізичній карті. Ця процедура вимагає знайти послідовність перекриття кожного велико-вставочного клона (у найкоротший шлях доріжки) і видалити перекриття частини однієї з двох послідовностей, щоб сформувати одну безперервну послідовність.

Картування на основі секвенування 2

Аналогія для стратегії основаної на картуванні послідовності на прикладі думок про геном як набір книг. Кожен том містить один ВАС послідовності. У стратегії на основі картування, спочатку визначається порядок обсягу. Потім визначається інформація в кожному з окремих томів. Нарешті, знання порядку і обсягу матеріалу в кожному томі об'єднані в єдину збірку.

Метод дробовика секвенування цілого геному1

Розроблений компанією Celera

Дочірня компанія Applied Biosystems, виробник автоматизованих секвенаторів

Немає картування

Замість цього, весь геном ріжеться

Випадкові послідовності

В якості альтернативи секвенування на основі картування, біотехнологічна компанія Celera розробила метод дробовика для секвенування великих геномів. Хоча цей метод був застосований для невеликих геномів таких як віруси, він вважався недоречним для великих геномів, що містять повторювані послідовності. (Celera була створена як дочірня компанія Applied Biosystems, виробник автоматизованих інструментів секвенування.) У цьому підході, не потрібно робити фізичні карти. Замість цього, весь геном розглядається як одна велика вставка клону. Він випадково ріжеться на фрагменти. (Celera використовували 2-кб, 10-кб, і 50-кб субклони). Ці фрагменти потім випадковим чином секвенуються, поки не буде достатнього охоплення.

Метод дробовика секвенування цілого геному 2

Щоб зрозуміти метод секвенування дробовика цілого генома, давайте використовувати аналогію книги ще раз: На сторінці кожного тому визначається інформація про випадкові фрагменти. Ця процедура виконується декілька разів, тому можуть бути знайдені пропозиції перекриття. Ґрунтуючись на цих перекриттях, вся робота потім збирається.

Метод дробовика секвенування цілого геному 3

Основні завдання: збірка

Повторювальні елементи є найбільшою проблемою

Виповнюється на дуже високо швидкісних комп'ютерах, з використання нового програмного забезпечення

Ключ до збірки в парному читанні

Послідовність обох кінців кожного клону

Головним завданням методу дробовика секвенування цілого геному це зібрання величезної кількості індивідуальних послідовностей, що читаються в одній безперервній послідовності. Комп'ютерна програма, що була написана команда на чолі з Myers, щоб зібрати послідовності ДНК. Для запуску програми потрібні одні з найшвидших комп'ютерів, що існують. Один з ключів до збірки послідовності є використання парного читання: При секвенувальному процесі, клони кодуються таким чином, щоб можна було визначити, коли клон читається з обох кінців.