Автоматизований секвенатор abi 3700

Виготовлений Applied Biosystems

Автоматизовані секвенсори мають: 96 капілярів

Робот який завантажує з 384-лункових пластин

За 2-3 години обробляється 600-700 основ

ABI 3700, зроблений Applied Biosystems, ймовірно, є найбільш широко використовуваним інструментом для великомасштабного секвенування. Він має 96 капіляри, на які робот вносить з двох 384-ямковий пластин для мікротитрування. Це обробляє послідовність кожні дві-три години і може читати в середньому 600-700 основи. Celera, компанія, яка випустила план Геному Людини на три роки, використовує 200 таких машин і працює 24/7, щоб зробити це.

Автоматизований секвенатор MegaBACE

Зроблений Amersham

Має 96 капілярів, робот завантажує 384 ямкових пластин, за2- 4 години читає 800 основ

Основним конкурентом ABI 3700 є MegaBACE 4000, зроблений Amersham. Він також має 96 капіляри і робот виконує навантаження від 384-ямковий пластин для мікротитрування. Це займає від двох до чотирьох годин в перспективі і може читати до 800 баз точно.

Автоматичне читання гелю

Верхнє зображення: конфокальна детекція секвенсора MegaBACE флуоресцентно мічених ДНК

Нижнє зображення: комп'ютерне зображення послідовності яку читає автоматизований секвенатор

Обидва автоматизовані секвенсори виявляють флуоресцентно мічені ланцюги ДНК, коли вони проходять через капіляри. Секвенатор MegaBACE використовує конфокальні системи візуалізації, що показано у верхньому зображенні. Зчитування даних у вигляді піків флуоресценції, яке показано на нижньому зображенні.

Кроки геномного секвенування

Створення бібліотек

• Велико-вставочні бібліотеки з генома

Процес секвенування

• Створенні фрагменти мають бути впорядковані

• Виконання послідовності реакцій

• Визначення послідовності

Обробка( заключний етап)

• Збирання безперервних послідовностей

• Усунення прогалин

Секвенування генома може бути розбите на кілька етапів. По-перше, створення бібліотек великих фрагментів геномної ДНК. Друга стадія процес секвенування сама по собі може бути розба на більш дрібні кроки. Ці кроки включають в себе створення невеликих фрагментів ДНК, які повинні бути послідовними, виконують поточні реакції секвенування, і запуск реакції через автоматизований секвенатор. Третій етап обробки, і вона включає в себе збірку вихідних послідовностей які складаються в безперервні послідовності, а потім заповнення прогалин які залишилися у послідовності.

Створення бібліотек

Бібліотека геномних фрагментів, зроблена у векторах

- BAC, PAC, або YAC

Зазвичай мають у декілька разів охоплення (coverage)

Кожна послідовність ДНК має від п'яти до восьми різних клонів

Важкі і неефективні послідовності безпосередньо з великих фрагментів

Потребують усунення на керовані частини

Випадково порізані

За допомогою рестрикраз або ультразвуком

Перший крок у великомасштабному секвенуванні, як правило, підготовка бібліотеки великих фрагментів геномної ДНК. Сьогодні, вектори, які найчастіше використовуються це BACs або PACs, але іноді YACs теж використовуються. Бібліотеки, як правило, зроблені з фрагментів досить великого розміру, щоб утримувати кілька разів охоплення генома, це означає, що будь-яка послідовність буде знайдена, в 5-8-ми копіях. Це важко і неефективно секвенувати безпосередньо від великих фрагментів, наступним кроком є звільнення кожного клону на керовані частини. Це робиться шляхом випадкового розрізання ДНК з кожного клону ультразвуком або за допомогою рестрикраз. Можуть бути отримані таким чином випадково порізані фрагменти певного розміру (наприклад, 2 Кб).

Фрагменти для секвенування

Як правило, використовують частини 2-10 кб для секвенування

Клонування в векторі секвенування

Містить сайти зв'язування праймерів для секвенування

Можуть бути одноланцюгові або дволанцюгові

Процес секвенування, як правило, здійснюється на фрагментах 2-10 Кб. Ці випадково порізані фрагменти повинні бути субклоновані в векторі секвенування, який містить сайти зв’язування з праймерими, що використовуються для ініціювання реакції секвенування. Векторів секвенування може бути одноланцюговий, як вектор фага М13, або дволанцюговий як плазміди.

Послідовність складання

Випадкові послідовності

Спочатку збираються в перекриваючі послідовності

Потім створюють одну безперервну послідовність

Програма, що використовується для цієї операції називається PHRAP

Аналізує кожну позицію, щоб визначити наступне:

Якість послідовність

Узгодження послідовностей в подібному регіоні

Отримані з різних випадкових фрагментів

Випадкові послідовності генерується з порізаних фрагментів спочатку їх збирають у перекриваючі послідовності. В залежності від бажаного охоплення, цьому кроку може знадобитися до 10 читань кожної частини ДНК. З цих перекриваючих послідовностей, складають одну безперервну послідовність. Ця задача, як правило, здійснюється з використанням автоматизованої програми для редагування відомої як PHRAP, розробленої Phil Green. Програма аналізує кожну позицію в послідовності і визначає якість кожного читання. Вона генерує послідовність консенсусу на основі різних послідовностей, що отримані з того ж регіону та їх внутрішньої узгодженості (тобто, як часто така ж основа буде знайдена в будь-якій позиції).

Зчитування зібраної послідовності

Зчитування програмою PHRAP, показує як перекриваючі послідовності вишикувалися в одну безперервну послідовність.

Обробка (Finishing) 1

Процес складання необроблених послідовностей читання в точну безперервну послідовність

Потрібна точність 1/10, 000

Управління процесом

Подивіться на послідовність читання в позиціях, де програма не може сказати, які основи є правильним

Усунення прогалин

Забезпечення адекватного охоплення

Хоча автоматизовані програми для редагування, такі як PHRAP значно підвищити ефективність секвенування, все одно залишається потреба в людських судженнях і втручаннях. Це відбувається під час останнього кроку обробки (finishing), який визначається як процес складання необробленої послідовності читання в точну безперервну послідовність генома. Для геномних послідовностей з точністю до однієї помилки на 10000 основи, крок ручної обробки має важливе значення. Дослідник дивиться на позиції, де автоматизована програма для редагування не може сказати, які основи є правильними. Досліджуючи різні необроблені послідовності читання, дослідник потім робить судження щодо правильної підстави або посилає ці області на додаткове секвенування. Аналогічним чином, коли є прогалини в послідовності або недостатнє охоплення, дослідник буде сигналізувати регіон і відправить його назад у процес секвенування для додаткової обробки.