Геномне секвенування

Стратегії та процедури для секвенування цілісного генома

У цій главі розглядаються різні стратегії і процедури, які використовуються для секвенування всього генома.

Зміст

Проект геному людини

Стратегії секвенування

Великомаштабне секвенування

Точність і масштабність

EST секвенування

Sequence annotation (анотації послідовності)

Теми, порушені в цій главі це проект генома людини, різні стратегії для секвенування геномів, використання великомасштабних послідовностей, як параметри точності і масштабності впливають на проекти послідовності геному, EST секвенування, анотації послідовності.

Вступ

Галузь геноміки почала з визначення послідовності генома людини

• Розмір геному людини становить 3 мільярди пар основ, які потребують нових способів секвенування

Підходи до секвенування генома людини

• Масштабування існуючих методів

• Розробка нових методів секвенування

• Починали з розшифровки менших геномів в якості розминки проекту

Галузь геноміки, метою якої є визначення структури та функцій усіх генів у геномі, почалася з визначення послідовності генома людини. Розмір генома людини, 3 млрд. пар основ, потребує нових способів секвенування. Три підходи були запропоновані: для розширення існуючих технологій секвенування, розробляти нові технології секвенування, і почати з розшифровки менших геномів якості розминки для секвенування геному людини.

Цілі проекту Генома Людини

Секвенувати весь геном

• не тільки транскрипційні гени

Секвенування повинно бути виконано дуже точно

• одна помилка на 10000 основ

Розробка геномних ресурсів, які будуть використані для всіх генів

Приклад: колекція фізичних маркерів

Розробка економії масштабу (Develop economies of scale)

На додаток до поліпшення технологій секвенування, проект Генома Людини має наступні цілі: секвенувати послідовність всього генома, а не тільки гени транскрипції або генів хвороб, секвенування генома з високим рівнем точності, з менш ніж однією помилкою на 10.000 основ (спочатку ця межа була встановлена ​​на рівні менше однієї помилки на 100.000 основ), розвиток геномних ресурсів, які будуть використані для всіх генів (наприклад, колекція фізичних маркерів) і в розробці економії масштабу. Ця остання мета привела до концентрації секвенування в кількох центрах, де воно здійснюється в промислових масштабах.

Розширення масштабів існуючих технологій

Значне поліпшення ефективності секвенування, починаючи з винаходу секвенування

Сума секвенувань, що може одна людина виконувати різко зросла

- 1980: 0.1-1 кб в рік

1985: 2-10 кб в рік

1990: 25-50 кб на рік

1996: 100-200 кб в рік

2000 рік: 500-1000 кб в рік

Майже все великомасштабні секвенування як і раніше базуються на методі Сенгера зупинки ланцюга.

Найбільший успіх прийшов у розширенні існуючих технологій. З 1980 по 2000 рік, ефективність секвенування збільшилася в тисячу разів і продовжує поліпшуватися. Останні оцінки є те, що одним з основних центрів секвенування був секвенований 100-MB геном ( розмір генома дрозофіли) на 5-кратному освітлення за два-три тижні. Зрозуміло, що не було суттєвих змін в базовій технології. Майже всі велико-масштабні секвенування як і раніше базуються на методі Сенгера зупинки ланцюга. Ця технологія детально описана в розділі, присвяченому основам картування та секвенування.

Нові технології

Завданням проекту Геном Людини, була розробка нових технологій картування і секвенування

На сьогоднішній день, не було зроблено нових технологічних проривів

• виключення: цілісно-геномний дробовик для секвенування великих геномів

Хоча першочерговою метою проекту Генома Людини була розробка нових технологій картування і секвенування , на сьогоднішній день не було зроблено великих проривів в цій області. Деякі перспективні нових методів описані в главі, присвяченій основам картування та секвенування. Одним з можливих прорив є застосування цілісно-геномного дробовика для секвенування великих геномів (описано далі в цій главі), але цей метод був розроблений приватною компанією і, отже, не є частиною офіційної проекту Генома Людини.

Автоматизовані секвенатори

Можливо, найбільш важливим внеском у великомасштабне секвенування була розробка автоматизованих секвенаторів

• більшість використовує метод Сенгера

• флуоресцентні мічені продукти реакції

• капілярний електрофорез для розділення

Секвенатори, що найчастіше використовуються:

• ABI

• MegaBACE

Мабуть, першорядне значення в забезпеченні великомасштабного секвенування має розробка автоматизованих секвенаторів. Усі наявні машини використовують метод зупинки ланцюга Сенгера і флуоресцентно мічені продукти реакції. Нові, високопродуктивні моделі використовують капілярний електрофорез для розділення продуктів реакції. Два найбільш часто використовуваних секвенатора ABI 3700 і MegaBACE.