Днк секвенування

Більшість сучасних проектів секвенування використовують метод обриву ланцюгів

- Також відомий як Сенгер секвенівання, в честь його винахідника

В основі діє ДНК-полімераза

- додає нуклеотиди в комплементарний ланцюг

Потрібні ДНК-матриця і праймери

Наймасштабніші проекти секвенування використовують метод обриву ланцюгів, який також відомий як Сенгер секвенування, після того, як Фред Сенгер, який виграв свою другу Нобелівську премію за винахід процесу. Секвенування обриву ланцюгів основане на дії ДНК-полімерази, яка додає нуклеотиди, які є доповненням до іншого ланцюга ДНК. Для того щоб він працював, потрібна ДНК-матриця , що може копіюватися, а також коротка ділянка ДНК, відома як праймер, до якого він можуть додаватися нуклеотиди.

Секвенування методом «обриву ланцюгів» Chain-termination sequencing

Дидезоксирибонуклеотиди зупиняють синтез

-обривають ланцюг

Наявні в таких кількостях, щоб припинити всякий раз, коли основа з'явиться в зразку

Використовується чотири реакції

• Один для кожної основи: A, C, G, та T

У методі Сенгера ланцюгового обривання , нуклеотидні аналоги називається дидезоксірибонуклеотидами. При правильній кількості додають у розчин, ланцюг буде припинено в кожному випадку комплементарних нуклеотидів в шаблоні. Причиною цієї реакції є те, що ДНК-полімераза не може додати ще один нуклеотиду до дидезоксінуклеотиду. Наприклад, якщо потрібна кількість дидезоксі А додається, то ланцюг буде припинено в кожному випадку Т в шаблоні. Визначення повної послідовності вимагає окремої реакції для кожної з чотирьох основ A, T, C і G. На верхній правій частині слайда матричний ланцюг, а під ним знаходяться різні ланцюги, які буде припинено з дидезоксі А в реакційній суміші.

Виявлення послідовності

Виявлення продуктів реакції секвенування

Включення мічених нуклеотидів

Раніше використовувалися радіоактивні мітки

Тепер флуоресцентні мітки

Використовуються різні флуоресцентні мітки для кожного нуклеотида

Можуть працювати всі чотири реакції в тій же смузі

Після завершення реакції секвенування , людина повинна бути в змозі виявити ланцюги породжених реакції. Це може бути зроблено за допомогою радіоактивного ланцюга з використанням радіоактивно мічених нуклеотидів в реакції. В якості альтернативи, автоматизовані секвенсори сьогоднішній день всі використовують флуоресцентні мітки. При такому підході кожна з чотирьох послідовність реакцій (для кожної з основ A, T, C і G) використовує інший колір флуоресцентної мітки. Після того, як реакція завершена, чотири флуоресцентно мічені реакції можуть бути об'єднані і працюють в одній смуги гелю або капілярній трубці.

Послідовність розподілу

Припинені ланцюги повинні бути відокремлені

Потрібна одна пара основ резолюції

-Дивіться різницю між ланцюгами X і X +1 пар основ

Гель електрофорез

-дуже тонкий гель

-висока напруга

-робота з радіоактивними або флуоресцентними мітками

Визначення розміщення кожної з основ в послідовності вимагає розділення припинення ланцюгів і їх вирішення(resolving), так що можна побачити відмінності одній базі. Це означає, наприклад, що ланцюг довжиною 35 основ повинні буде відрізнятися від ланцюга 34 або 36 основ. Цей крок, як правило, здійснюється за допомогою електрофорезу за допомогою гелю або капіляру. Спочатку, були використані дуже тонкі гелі, з застосуванням високої напруги. Або радіоактивно мічені або флуоресцентно мічені продукти реакції можуть бути розділені на гелі. Зображена в цьому слайд-шоу авторадіограмми типова послідовність геля з смугами позначені відповідно до дидезоксі термінатора. Для гелю-електрофорезу, негативний полюс був зверху, а позитивний полюс внизу.

Послідовність читання радіоактивно міченої реакції

Радіоактивні помічені реакції

• Гель сушать( Gel dried)

• Розміщують на рентгенівській плівці

Послідовність читається знизу вгору

Кожна смуга являє собою різні основи

На заключному етапі секвенування, щоб прочитати послідовності. Після радіоактивного мічення послідовності реакцій проходять через гель, гель сушать, а потім розміщують на рентгенівській плівці. Після фільму «розвивається», положення кожної групи стає видимим. Послідовність потім читають з нижньої частини гелю на вершину, з кожної з чотирьох смуг даючи позицію іншої основи: A, T, C або G.

Послідовність читання флуоресцентно мічені реакції

Флуоресцентно мічені реакції сканується лазером, що в певний момент передається ( чи в певний момент минає??)

Колір підібраний детектором

Вихідні дані направляється безпосередньо до комп'ютера

Для флуоресцентно мічених реакцій, які розділяються або гелем-електрофорезом або через капіляри, фрагменти виявлені лазером, як вони проходять певну точку. Кожен з чотирьох кольорів підібраний за допомогою детектора, а вихідні дані надходять безпосередньо на комп'ютер. Зчитування дається як з точки зору основ і з точки зору інтенсивності кожного кольору, так що неоднозначні свідчення легко ідентифікуються.

Висновки методу обриву послідовності ланцюга

На картинці наведені кроки секвенування ДНК. Праймер подовжується ДНК-полімеразою на основі послідовності, що присутня . Ланцюг переривається різними дидезоксінуклеотидами які додаються до матричного ланцюга. Чотири реакції, по одному для кожної основи, розділені на гелі, який може вирішити одну базу відмінності. Послідовність потім читають з нижньої частини гелю на верх.

Полімеразно ланцюгова реакція

Використовується в послідовності, діагностики, порівняльній геноміці і т.д.

Використання термостабільної ДНК-полімерази

• Здатна працювати майже при температурі кипіння

Два праймери, комплементарні послідовності в 5 'і 3' регіонах будуть ампліфікуватися

Дволанцюгова ДНК матриця

Використання термоциклів, запрограмованих для підйому та опускання температури

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) революція в біології, коли вона була введена в 1980 році. В даний час використовується в послідовності, діагностиці, порівняльній геноміці, і інших областях. Прорив в цій технології прийшли з відкриттям термостабільних полімераз ДНК, виділених з бактерій, які живуть в киплячій воді гейзерів. Термостабільні полімерази, як і всі ДНК-полімерази, потребують матриці і праймерів для роботи. Для ПЛР-, двох праймерів, однин додається до 5 'кінця матриці буде посилюватися й інший додається до 3' кінця.Матриця , як правило, дволанцюгова ДНК. Реакція проводиться в термоциклі, також відомих як машина ПЛР, який запрограмований, щоб піднімати і опускати температуру реакції дуже швидко і точно.

ПЦР машини

Два різних типа машин ПЛР показано на цьому зображенні. Обидва мають можливість швидко і точно змінювати температури реакції між 48 і 96 спеціально розроблених tubes .

ПЛР-реакція: відпал праймерів

Матриця розчинилися в два ланцюга від високої температури > 90 ° C

Відпал праймерів для обох ланцюгів

Полімераза створює копію обох ланцюгів

У реакції ПЛР, дволанцюжкова ДНК-матриця спочатку розплавляється, або денатурує, на два ланцюга шляхом нагрівання лунок до температури вище 90 градусів за цельсієм. Потім температура зменшується настільки, що прямий і зворотний праймери можуть відпалюватися. Ідеальна температура відпалу залежить від G + C вмісту праймерів. Потім температура підвищується до 70 градусів цельсія, з тим щоб термостабільні полімерази продовжували праймери.

ПЛР-реакція: ампліфікація

Температура підвищується до розплаву новосинтезованої ДНК

Праймери готові до відпалу, коли температура падає

Полімераза подовжує новий ланцюг ДНК

Процес повторюється

Експонентний ріст ДНК

На цьому етапі, знову утворюються дволанцюгові ДНК-матриці. Якщо вихідна матриця була більшою, ніж в регіоні ампліфікації, то в першому етапі знову утворена дволанцюговаДНК матиме один кінець, що більше, ніж хотілося б. Потім процес повторюється: при підвищенні температури, щоб плавити новосинтезовані ДНК. ріст в ДНК. Ось чому ПЛР може бути використаний для ампліфікації ДНК з невеликого зразка крові або трохи тканини, знайдені в древніх кістках.