Крок 4: Бібліотека скринінгу

Колонії ДНК прикріплені до мембрани

ДНК скринінг з міченими зондами

ДНК, радіактивно мічене

Мічене ДНК дозволяє гібридизацію ДНК на мембрані.

Після відмивання, позитивні точки(плями) гібридизації ідентифіковані.

Бібліотеки мають кілька потенційних застосувань. Найбільш поширеною є спроба ізолювати клон з послідовності, ідентичні або схожі на відомі фрагменти ДНК. Гібридизація, що дає взаємодоповнюючий характер для двох ланцюгів ДНК, використовується для пошуку в бібліотеці ідентичних або схожих послідовностей. Цей процес відомий як скринінг бібліотек. На екран (screen – ширма) бібліотеки, ДНК в кожній бактеріальній колонії спочатку прикріплюється до нейлону або нітроцелюлозної мембрани. Цей результат досягається шляхом розміщення мембрани над колоніями і дозволяючи їм прилипати до неї. Мембрану потім видаляють і обробляють пошкоджені клітини і прикріплене незворотньо ДНК, яка вивільняється з клітин. Зонди помічені і гібрідізовані з ДНК прикріплені до мембрани (описано далі в цій главі). Після промивання і впливу рентгенівської плівки, місце розташування колонії, що містять конкретні кДНК може бути візуалізоване.

КДнк est

Для використання в послідовності EST:

• Потрібно масиву індивідуальних клонів

Бібліотека поширюється на бактеріальну пластину

Окремі колонії (збираються) відсортовуються

Колонії перебувають у пробірках або планшетах для мікротитрування

Інше застосування бібліотек кДНК в EST (виражена послідовність тегів) послідовності. У цьому підході геноміки секвенування (описані в главі про секвенування геному), випадкові кДНК клони виділяють і секвенують. Ця операція зазвичай вимагає побудови окремих клонів. Це завдання може бути зроблено різними способами, але найчастіше включає в себе розповсюдження бібліотеки на поживний агар бактеріальних пластин. Бібліотека поширюється таким чином, що кожна колонія відділена від своїх сусідів. Автоматичні збирачі колонії використовується для вибору окремих колоній і поміщають їх в пробірки або мікротитрувальні пластини, які мають багато дрібних свердловин ( дірочок), які підходять для маніпуляцій роботів.

Збір колоній

Автоматичні збирачі колонії грають ключову роль в галузі геноміки.

Замість того щоб вручну зібрати одну колонію в той час, вони ідентифікують і збирають кілька колоній з плит.

Збирачі потім вносять в кожну колонію мікротитрувальну луночку (microtiter well).

Автоматичні збирачі колоній є ще одним прикладом того, як геноміку застосовують в промислових підходах до методів рекомбінантної ДНК . Раніше колоній з геномних або кДНК бібліотек були виділені вручну, встромивши зубочистку в них або аспіраціюючи їх з піпетки Пастера. Автоматизовані збирачі колоній в змозі визначити місце розташування колонії на чашці і одночасно передавати зміст великого числа колоній на окремих мікротитрувальних луночках.

Гібридизація

Основа мікрочіпів для визначення експресії генів

Процес, в результаті якого комплементарні ланцюги знаходять один одного

A–T and C–G base pairing (pairing, поєднуються –спарення)

В залежності від температури, солі, послідовності і концентрації

Гібридизація з двох ланцюгів нуклеїнових кислот є основою для геномної технології мікрочіпів, які використовуються для визначення рівня експресії гена. Гібридизація це процес, при якому два комплементарних ланцюга нуклеїнових кислот знаходять один одного. Це залежить від спарення комплементарних основ і додаткових основ C і G. Швидкість і точність гібридизації залежать від температури і концентрації солі в реакційній суміші, а також послідовності і концентрації нуклеїнових кислот, що їх гібридизували . Чим вища температура, тим швидше два комплементарних ланцюга знаходять один одного і відпал. Але висока температура також викликає невідповідність, пари ламаються швидше. Аналогічним чином, більш висока концентрація солі буде мати тенденцію до стабілізації спарених основ , які не доповнюють один одного. Таким чином, низька концентрація солі в поєднанні з високою температурою використовуються для забезпечення того, щоб гібридизація комплементарних ланцюгів віддавала перевагу більшості неспецифічних взаємодій.