Технічні основи геноміки

Методи рекомбінантної ДНК, що використовуються в галузі геноміки.

У даній главі розглядаються методи рекомбінантної ДНК, які складають основу для більшості геномних методологій.

Зміст

Геномніка і бібліотеки кДНК

Гібридизація та Нозерн Блот

Субклонування

Рестрикційно-ферментне картування

Секвенування ДНК

ПЛР-ампліфікації

Білкова єкспрессія

Теми, порушені в цій главі, включають геномніку і конструювання бібліотек кДНК гібридизацію і її застосування в Нозерн блоттингу, субклонування, рестрикційно-ферментне картування, секвенування ДНК, ПЛР-ампліфікації і білкову експрессію.

Геноміка і бібліотеки кДНК

Бібліотеки це фрагменти ДНК клоновані у векторі

Бібліотеки, як правило, побудовані до секвенування

Геномні бібліотеки використовуються для genomewide (обширного) секвенування кДНК бібліотек, необхідних для секвенування EST.

Термін "бібліотека" використовується для колекцій фрагментів ДНК, які клонували у вектор. "Вектор" це термін, використовуваний для молекул ДНК, функція якого полягає в перенесенні інших частин ДНК. Назва "Бібліотека" є трохи неправильною, тому що, клони в них не є упорядкованими з індексами. Насправді, колекції більше схожі на смітники, які можна знайти за допомогою металошукача. Наймасштабніші проекти секвенування почати з конструювання геномної бібліотеки або бібліотеки кДНК. Геномні бібліотеки для обширного секвенування. кДНК бібліотеки отримані з РНК, за допомогою зворотної транскрипції в кДНК і використовуються для EST проектів секвенування.

Геномні бібліотеки

Виготовлені з фрагментів геномної ДНК

-Геномну ДНК розрізали рестриктазами або випадково порушивши механічний зсув??

Фрагменти лігіруються в векторах для клонування

-Малі вставки

- -фаг лямда

-- плазміда

-Великі вставка

--BACs

Геномні бібліотеки, складаються з фрагментів геномної ДНК. Для отримання фрагментів правильного розміру для клонування геномної ДНК або ріжуть рестриктазами або випадково ламають(randomly broken). Випадкове ламання може бути досягнуто шляхом проведення хромосомної ДНК через невеликий отвір, як голка шприца або за допомогою ультразвуку. Геномні фрагменти, що отримані за допомогою ферментативного розщеплення або механічного зсуву потім лігують в клонуючий вектор. Є безліч векторів для клонування, які розрізняються за розміром фрагмента ДНК, який можуть вмістити. Менші вставки в діапазоні 20-40 кб може бути клонований в плазміду або в вектор фага-лямбди, а великі вставки 100-300 кб можуть бути клоновані у вектори, такі як бактеріальні штучні хромосоми (БАС) (BACs). Навіть великі вставки до 1 МБ можуть бути розміщені в штучні хромосоми дріжджів (YAC).

Створення бібліотек кДнк

Крок 1: Ізолювати РНК

РНК очистити від тканин або клітин

мРНК ізолювати від рибосомних і тРНК

Колонка з оліго dT використовується для зв'язування полі А

В основі кДНК бібліотеки є РНК, які очищають від тканин (наприклад, серця або шкіри) або з клітинної лінії. Щоб отримати тільки РНК (мРНК) і позбутися некодируючих РНК, таких як рибосомальна РНК і тРНК, для цього використовується оліго dT хроматографія. Для цього використовуються короткі відрізки нуклеотидів тимідину, які прив'язані до колонки або магнітні кульки. Оліго dT зв'язується з хвостом ПоліА, що знайдені знайдені на всіх РНК,. Елюція з колонки призводить до відносно чистої популяції молекул мРНК.

Крок 2: Отримання кДнк з рнк

мРНК обробляють ферментом зворотної транскриптази.

Ферментні копії послідовності мРНК в перший ланцюг ДНК.

Інший фермент використовується, щоб зробити другий ланцюг кДНК.

Ізольовану мРНК потім інкубують з ферментом зворотної транскриптази. Цей фермент дає можливість скопіювати послідовність РНК в комплементарну ДНК (кДНК) . Для цього потрібна матрична РНК, праймер (як правило, оліго dT), і досить нуклеотидів. Після першого ланцюга кДНК, що був зроблений, РНК перетравлюється від використання ферменту РНКази H. Тоді інший фермент (або зворотної транскриптази) використовується для копіювання першого ланцюга, щоб зробити другий ланцюг кДНК.

Крок 3: Трансформація

Дволанцюгову кДНК вставляють в клонуючий вектор.

кДНК лігують в клоную чому векторі ( плазміді або фагові)

Вектор трансформують або інфікують ним бактерію.

Дволанцюгову кДНК лігують в клонуючий вектор. Цей вектор, як правило, є плазмі дою або вектор фага ,так як кДНК рідко перевищує 10 кб. Клони потім вводяться в бактерію шляхом трансформації у випадку плазміди або інфікуються в разі фага. В ідеальній бібліотеці, кожна колонія чи бляшка (plaque) містить різні клони, які виникли з однієї молекули мРНК. Насправді, бібліотека кДНК може сильно відрізнятися за якістю. Нерідкі випадки, коли значний відсоток клонів в бібліотеці не містятить вставки. В інших випадках, вставки можуть бути дуже короткими, що становить лише часткове копіювання РНК в кДНК.