3.3Ферменти бактерій, їх роль в обміні речовин. Ферменти патогенності. Використання для диференціації бактерій.

Для відтворення метаболічних процесів бактерії використовують ферменти. Їх набір – генетично детермінована ознака. Вивчення ферментативної активності збудників проводять з метою ідентифікації.

Класифікація ферментів

За механізмом дії:

 оксидоредуктази

 трансферази

 гідролази

 ліази

 лігази

 ізомерази

За місцем локалізації:

 ендоферменти – локалізуються в цитоплазмі, ЦПМ або периплазматичному просторі

 екзоферменти – виділяються в зовнішнє середовище

За генетичним контролем:

Конститутивні – постійно синтезуються клітиною

Індуктивні – синтезуються в присутності субстрату

Репресивні – їх синтез пригнічується надмірним накопиченням продуктів метаболізму реакції, яка ними каталізується

За субстратом:

 протеолітичні

 цукролітичні

- ряд Гісса(глюкоза, лактоза, маніт, мальтоза, сахароза +МПБ+ індикатор);

- довгий ряд Гісса - до 20 вуглеводів;

- СистемиІндикаторніПаперові;

- Тест системи (ентеротести,стафілотести);

- системи мультимікротестів;

- середовища ДСС(Енна, Лєвіна, Плоскірєва).

 Лі політичні

 Амілолітичні

 Пептолітичні

 Гемолітичні

 Лецитиназна активність

Окрема група - ферменти захисту та агресії

Практичне значення

Ферменти використовують:

 з метою ідентифікації збудників інфекційних хвороб

 як лікувальні препарати:

- фібринолізин – для попередження тромбоемболій при свіжих інфарктах

- пеніциліназа – для профілактики анафілаксії на пеніцилін

 стрептодорназа – для розрідження гною і полегшення дренажування

 в промисловості їх використовують у виробництві біологічних препаратів (вітаміни групи В, аскорбінової кислоти, амінокислот, генній інженерії )

Ферменти патогенності:

- Гіалуронідаза – руйнує гіалуронову кислоту сполучної тканини

- Лецитиназа – руйнує лецитин клітинних оболонок

- ДНК-аза та РНК-аза

- Фібринолізин – руйнує фібрин кров´яних згустків

- Плазмокоагулаза – коагулює білки плазми, закриває власні рецептори

- Колагеназа – руйнує колаген

- Гемолізин – руйнує мембрани еритроцитів

3,4Ріст і розмноження бактерій. Механізм клітинного поділу, фази розмноження культури бактерій у стаціонарних умовах.

Ріст – процес збільшення біомаси клітини внаслідок синтезу нових речовин

Розмноження – процес відтворення подібних собі особин, який забезпечує існування виду

Механізми розмноження(клітинного поділу):

 бінарний поділ

 дроблення і спороутворення (у актиноміцетів)

 брунькування

Фази розмноження бактерій в ізольованому середовищі

 Лаг-фаза – адаптація до нових умов

 Експоненціальна фаза – інтенсивне розмноження (збільшення кількості особин в геометричній прогресії)

 Стаціонарна фаза – кількість відмерлих особин дорівнює кількості живих, що розмножуються

 Фаза відмирання – інтенсивне відмирання (кількість відмерлих збільшується в геометричній прогресії)

Крива росту мікроорганізмів в поживному середовищі

3.5Бактеріологічний метод дослідження. Принципи виділення чистих культур бактерій та їх ідентифікації

| Методы выделения чистых культур. Выделение от¬дельных видов бактерий и получение чис¬той культуры являются основой бактери¬ологической работы, так как на практике чаще всего приходится иметь дело с материалом, содержащим смесь микробов. Установление же вида микроба и изучение всех его свойств возможно только тогда, когда бактерии полу-чены в чистом, изолированном виде, т. е. в чистой культуре. Основной задачей при исследовании материала, содержа¬щего смесь микробов, является получение отдельных коло¬ний (скопление микробов одного вида, выросших из одного зародыша) по возможности всех микробов, находящихся в исследуемом материале. Простейший способ — механичес-кое разобщение микробов на поверхности плотной пита¬тельной среды. Для этой цели наиболее часто применяется агар, разливаемый в так называемые чашки Петри (рис 49).

Выделение чистых культур методом рассева на чашки. Посев шпателем (метод Дригальского). Простейшим спо¬собом разъединения микробов является последовательное

растирание материала стеклянным шпателем (рис. 50) или петлей по поверхности агара на нескольких чашках Петри с питательной средой.

Агар в чашках приготовляют заранее следующим обра¬зом: стерильный агар, находящийся в колбах или флаконах, расплавляют на водяной бане. Колбу с расплавленным ага¬ром берут в правую руку, а левой вынимают пробку. Обжи¬гают горлышко колбы и большим и указательным пальца¬ми левой руки приподнимают крышку чашки лишь настоль¬ко, чтобы в щель могло пройти горлышко колбы со средой. Вводят горлышко под крышку чашки (не касаясь ее краев), наливают в чашку 10—15 мл питательной среды, быстро выводят горлышко колбы из чашки и закрывают ее крыш-ку. Тотчас же обжигают край горлышка колбы и пробку и

закрывают колбу. Если среда не распределилась равномер¬но по дну чашки, то, осторожно покачивая чашку, среду распределяют ровным слоем толщиной приблизительно 0,5 см. Пока среда не застынет, чашки нельзя передвигать или переносить. Застывшую среду подсушивают в термо¬стате или в закрытых чашках в течение 1—2 часов или в от¬крытых чашках в течение 30 минут. В последнем случае от¬крытые чашки помещают дном вверх на полках термостата, покрытых стерильной бумагой.

Первый день: посев исследуемого матери¬ала. Посев производится на трех пронумерованных чаш¬ках Петри (I, II, III) с питательной средой. Для посева за¬ранее заготовляются стеклянные шпатели, завернутые в бумагу и простерилизованные. Можно сделать шпатель из пастеровской пипетки, загнув под углом ее конец в.пламе¬ни горелки.

1. На поверхность питательной среды в чашке I наносят петлей или стерильной пастеровской пипеткой каплю иссле¬дуемого материала и растирают ее стерильным шпателем, двигая его сначала взад и вперед на небольшом участке, а затем круговыми движениями по всей поверхности пита¬тельной среды. При этом крышку чашки приоткрывают ле¬вой рукой лишь настолько, чтобы в щель мог пройти шпа¬тель.

2. Вынимают шпатель из чашки I, закрывают ее и быст¬ро переносят шпатель в чашку II, не прожигая его. Растирают материал по всей поверхности среды, прикаса¬ясь к ней той же стороной шпателя, которой растирался материал в чашке I. Чашку II закрывают.

3. Так же переносят шпатель в чашку III и растирают материал по поверхности питательной среды той же сторо¬ной шпателя. Закрывают чашку. Шпатель прожигают или опускают в дезинфицирующую жидкость.

4. Чашки надписывают (название материала, фамилия больного, дата) и ставят в термостат вверх дном, чтобы об¬разующиеся капельки паров воды, попадающие на крышку, не стекали на поверхность среды и не размывали посева. Чашки находятся в термостате 18—24 часа.

Второй день: изучение колоний и выделе¬ние чистых культур. Через сутки засеянные чашки вынимают из термостата и изучают полученные посевы. На

чашке 1, где было много материала, получился сплошной рост бактерий и отдельных колоний не видно. На чашке II и в особенности на чашке III колонии распределились изо¬лированно, поэтому легко доступны исследованию (рис. 51).

Прежде всего изучают колонии макроскопичес¬ки, невооруженным глазом. Просматривают чашку (не от¬крывая) со стороны дна в проходящем свете, держа ее на уровне глаз на расстоянии 20—30 см. Обнаруживают, что посев смеси микробов дал рост неоднородных колоний. От¬мечают величину колоний (крупная, мелкая, точечная), форму (правильная круглая, неправильная, плоская, воз¬вышающаяся над поверхностью среды), цвет (бесцветная, окрашенная), консистенцию (плотная, крошащаяся, мяг¬кая), характер поверхности (гладкая, морщинистая, блес-тящая, тусклая, влажная, сухая, слизистая и т. д.).

Еще лучше видна разница в структуре колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого пользуются или

лупой, или вынутым из тубуса микроскопа окуляром', или микроскопом со слабой сухой системой при суженной диаф¬рагме или несколько опущенном конденсоре. При изучении под микроскопом чашку помещают на столике вверх дном и, передвигая ее, отмечают на ней карандашом колонии различной формы, очерчивая их кружком.

Под микроскопом резко выявляется строение колоний: характер краев (ровные, фестончатые, зазубренные), характер поверхности (гладкая, шероховатая), структура (гомогенная, зернистая, однородная или различающаяся в центре и по периферии).

Каждому виду микробов свойствен определенный харак¬тер колоний. Нередко характер колоний имеет диагности¬ческое значение для определения возбудителей болезни.

3. Из части каждой из намеченных колоний делают маз-I ки, окрашивают их по Граму.

Намеченные колонии пересеваются в пробирки с косым агаром. Из остатка колонии, находящегося на петле после посева, следует приготовить мазок и чжрасить его, чтобы микроскопией проверить чистоту изучаемой колонии и мор¬фологию микробов в ней.

Пробирки с посевами помещают в термостат на 18—24 часа.

4. Производят подсчет колоний (см. ниже).

Третий день: проверка чистоты культуры и изучение свойств микроба. Через сутки про¬бирки с посевами вынимают из термостата и убеждаются, что в каждой из них получен посев однородной культуры. Проверяется чистота культуры и изучается морфология бактерий в мазках, окрашенных по Граму. Посев петлей. Выделение чистых культур из смеси мик¬робов можно сделать посевом петлей штрихом.

1. Простерилизорованной на пламени горелки и охлажден¬ной петлей берут материал для посева и осторожно вводят петлю в чашку.

2. На поверхности питательной среды распределяют ма¬териал петлей параллельными штрихами на расстоянии 0,5 см один от другого от одного края чашки к другому, держа петлю плашмя (не царапать питательной среды).

3. Вынимают петлю из чашки. Тотчас же, закрыв чашку, обжигают петлю и ставят ее в штатив.

4. Чашку надписывают и помещают в термостат вверх дном на сутки.

Рост на агаре на первом штрихе сплошной, на следую¬щих — изолированными колониями.

Все дальнейшие манипуляции с изолированными коло¬ниями совершенно такие же, как при посеве шпателем.

При достаточном навыке посев петлей исследуемого ма¬териала (взятого в небольшом количестве) производят лишь на одну чашку с агаром, получая в последних штри¬хах рост микробов в виде изолированных колоний.

Метод пластинчатых разводок Коха. Этот метод выделе¬ния чистых культур на плотной среде употребляется в тех случаях, когда нужно произвести количественное оп¬ределение микробов — подсчет микробов в определенном объеме исследуемого материала (вода, гной и т. д.).

1. Расплавляют в кипящей воде в нескольких пробирках по 9 мл агара, а затем охлаждают его до 50—55°, оставляя пробирки на все время работы в горячей воде такой же тем¬пературы.

2. Стерильной пипеткой набирают 1 мл исследуемого ма¬териала, вносят в первую пробирку с агаром и переме¬шивают. Получается разведение 1(Н.

3. Далее последовательно переносят по 1 мл из пробир¬ки в пробирку, получая таким образом соответствующие разведения: 10^2, 10~3 и т. д. Количество пробирок, взятых в опыт, зависит от степени загрязненности исследуемого ма¬териала.

4. Приготовив разведение, приступают к разливке засе¬янного агара в стерильные чашки Петри (для того чтобы агар распределился равномерно, а не застыл комками, ре¬комендуется предварительно согреть чашки в термостате или же слегка нагреть над пламенем горелки): берут про¬бирки по порядку, открывают, обжигают край, выливают содержимое в чашку, открыв крышку лишь настолько, что¬бы в щель вошло устье пробирки.

Опорожненную пробирку и пробку опускают в дезинфи¬цирующий раствор или в специальный бак с крышкой. По¬качиванием чашки распределяют агар равномерно по всей поверхности ее дна.

5. Отмечают на чашках разведения, дают агару застыть и помещают чашки вверх дном в термостат на 18—24 часа.

Счет колоний. Для определения количества выросших колоний, а следовательно, степени загрязненности материала применяют либо прямой их подсчет через лупу, либо в случаях большого количества выросших колоний — при помощи специальных камер. Камеры для подсчета колоний представляют собой стеклянные пластинки, укрепленные на подставках и разделенные на ряд квадратов площадью 1 cmz. Некоторые из этих квад¬ратов в свою очередь разде¬лены на 9 малых квадратов (рис. 52).

Удобен для счета колоний специальный электроприбор с импульсным счетчиком, показания которого увеличивают¬ся при подсчете колоний электропером.

Выделение чистых культур анаэробов

Первый день. 1. Накопление материала. Иссле¬дуемый материал (например, землю, гной) засевают пасте¬ровской пипеткой на среду Китта — Тароцци, прокипячен¬ную в течение 20 минут перед посевом и'остуженную. После посева материала среду нагревают 15 минут при 80° для уничтожения вегетативной флоры; споры анаэробов п.^и этом не гибнут. Пробирки с посевом ставят в термостат. "

Второй день*. Через сутки среда оказывается помутнев¬шей (рост микробов), иногда в ней видны пузырьки газа. Делают мазки, окрашивают их по Граму и обнаруживают крупные споровые и неспоровые грамположительные па¬лочки. Микроскопическая картина дает только ориентиро¬вочное представление о микробной флоре исследуемого ма-териала.

2. Выделение чистой культуры может быть произведено по одному из следующих методов.

а) По Цейсслеру: каплю материала со среды Кит¬та— Тароцци помещают на середину чашки I с кровяным сахадным агаром, и распределяют по ней стеклянным шпа¬телем; этим же шпателем производится посев в чашках II и III. Чашки с посевами помещаются в термостат в анаэ¬робных условиях. На следующий день по форме колоний (при рассматривании через лупу) и микроскопии мазков из них производится ориентировочное определение вида мик-Чоба и пересев отдельных намеченных колоний на среду «дота — Та_2сцци для выделения чистой культуры и точно определения вида микроорганизмаб) По Вейнбергу: несколько капель из посева на треде Китта — Тароцци переносят в пробирку с бульоном, рткуда затем запаянным концом капилляра пастеровской [пипетки переносят их последовательно в несколько узких /Пробирок (или трубок Виньяля) с растопленным, прокипя¬ченным а течение 20 минут и слегка остуженным сахарным агаром. Засеянные пробирки (или трубки) быстро охлаж-дают~Толодной водой дЬ застывания и помещают в термо¬стат На следующий дінь изучают форму выросших коло-

ний и отмечают колонии для пересева, затем производят распил трубки или пробирки у места отмеченной колонии. Колонию высасывают пастеровской пипеткой и засевают на среду Китта — Тароцци.

Методы выделения чистых культур. Выделение от¬дельных видов бактерий и получение чис¬той культуры являются основой бактери-ологической работы, так как на практике чаще всего приходится иметь дело с материалом, содержащим смесь микробов. Установление же вида микроба и изучение всех его свойств возможно только тогда, когда бактерии полу¬чены в чистом, изолированном виде, т. е. в чистой культуре. Основной задачей при исследовании материала, содержа¬щего смесь микробов, является получение отдельных коло¬ний (скопление микробов одного вида, выросших из одного зародыша) по возможности всех микробов, находящихся в