Тема 6. Биотехнологический производственный процесс и основные принципы его организации (5 часов)

 

1. Основные принципы промышленной организации биотехнологических процессов (1 час)

2. Стадии биотехнологического производства (1 часа)

3. Способы и системы культивирования микроорганизмов (1 часа)

4. Методы, используемые в биотехнологическом производстве (0,5 часа)

5. Концентрирование, обезвоживание, модификация и стабилизация продукта (1 часа)

6. Получение готовых товарных форм препаратов (0,5 часа)

6.1. Многообразные биотехнологические производственные процессы, в результате которых создается промышленная биотехнологическая продукция, необходимо соответствующим образом организовать, обеспечив их эффективное функционирование в целях выпуска конкретных видов продукции, удовлетворяющих потребности рынка биотехнологий.

Организация биотехнологических производственных процессов состоит в объединении людей, орудий и предметов труда в единый процесс производства материальных благ, а также в обеспечении рационального сочетания в пространстве и во времени основных, вспомогательных и обслуживающих процессов, необходимых для эффективности функционирования биотехнологических производственных систем. Пространственное сочетание элементов биотехнологического производственного процесса и всех его разновидностей реализуется на основе формирования производственной структуры предприятия и входящих в него подразделений. В связи с этим важнейшими видами деятельности являются выбор и обоснование производственной структуры предприятия, то есть определение состава и специализации входящих в него подразделений и установление рациональных взаимосвязей между ними.

В процессе разработки производственной структуры выполняются проектные расчеты, связанные с определением состава парка оборудования по производству биотехнологических продуктов, учетом его производительности, взаимозаменяемости, возможности эффективного использования. Разрабатывается рациональная планировка подразделений, размещения оборудования, рабочих мест. Создаются организационные условия для бесперебойной работы оборудования и непосредственных участников биотехнологического производственного процесса – специализированных рабочих.

Важный элемент организации биотехнологического производственного процесса – организация труда работающих как конкретная реализация процесса соединения рабочей силы со средствами биотехнологического производства. Организация биотехнологических производственных процессов предполагает также необходимость сочетания их элементов во времени, что выражается в установлении порядка выполнения отдельных операций, рациональном совмещении времени выполнения различных видов работ, определении календарно-плановых нормативов движения предметов труда. Нормальное функционирование процессов во времени обеспечивается также порядком получения готовой продукции, созданием необходимых запасов и производственных заделов предприятий по производству биотехнологических продуктов, снабжение рабочих мест инструментом и материалами, то есть рациональной организацией движения материальных потоков. Эти задачи решаются на основе разработки и внедрения систем оперативного планирования биотехнологического производства с учетом его специфики и технико-организационных способностей биотехнологического производственного процесса.

Наконец, в ходе организации биотехнологических процессов производства на предприятии немаловажное место отводится разработке системы взаимодействия отдельных производственных подразделений.

Принципы организации биотехнологического производственного процесса представляют собой исходные положения, на основе которых осуществляется построение, функционирование и развитие биотехнологических производственных процессов предприятия.

Принцип дифференциации предполагает разделение биотехнологического производственного процесса на отдельные части (биотехнологические процессы, операции) и их закрепление за соответствующими подразделениями предприятия.

Принципу дифференциации противостоит принцип комбинирования, который означает объединение всех или части разнохарактерных процессов по изготовлению определенных видов биотехнологической продукции в пределах одного участка, цеха или производства. Все биотехнологические производственные процессы, происходящие на данных предприятиях, имеют разнохарактерные характеристики.

Принципы дифференциации и комбинирования распределяются и на отдельные рабочие места. В практической деятельности по организации производства приоритет в применении принципов дифференциации и комбинирования должен отдаваться тому принципу, который обеспечит наилучшие экономические и социальные характеристики производственного процесса. Однако чрезмерная дифференциация повышает утомляемость рабочих, большое количество операций увеличивает потребность в оборудовании и производственных площадях, ведет к излишним затратам на перемещение и т.д.

Принцип концентрации означает сосредоточение определенных производственных операций по изготовлению однородной биотехнологической продукции или осуществлению однородных работ на участках биотехнологической производственной системы. Целесообразность концентрации однородных работ на отдельных участках биотехнологического производства этих предприятий обусловлена следующими факторами: общность технологических методов, вызывающих необходимость применения однотипного оборудования; возможностями оборудования, возрастанием объемов выпуска отдельных видов биотехнологической продукции; экономической целесообразностью концентрации биотехнологического производства определенных видов продукции или выполнения однородных работ.

Принцип специализации основан на ограничении разнообразия элементов биотехнологического производственного процесса предприятия. Реализация этого принципа предполагает закрепление за каждым рабочим местом и каждым подразделением строго ограниченной номенклатуры работ, операций или изделий. В противоположность принципу специализации универсализация – это такой принцип организации биотехнологического производства предприятия, при котором каждое рабочее место или производственное подразделение занято изготовлением биотехнологического продукта широкого ассортимента или выполнением разнородных биотехнологических производственных операций.

Принцип пропорциональности заключается в закономерном сочетании отдельных элементов биотехнологического производственного процесса, которое выражается в их определении количественном соотношении друг с другом. Так, пропорциональность по производственной мощности предполагает равенство мощностей участков или коэффициентов загрузки оборудования.

Отсюда требование: иметь в каждой производственной структуре оборудование, площади, рабочую силу в таком количестве, которые бы обеспечивало нормальную работу всех подразделений предприятия. Такое соотношение в пропускной способности должно существовать и между основным производством, с одной стороны, и вспомогательными и обслуживающими подразделениями – с другой.

Нарушение принципа пропорциональности ведет к диспропорциям, появлению «узких мест» в биотехнологической производстве предприятия, вследствие чего ухудшается использование оборудования и рабочей силы, возрастает длительность биотехнологического производственного цикла, увеличиваются заделы. Принцип пропорциональности предполагает одновременное выполнение отдельных операций или частей биотехнологического производственного процесса. Он базируется на положении о том, что части расчлененного биотехнологического производственного процесса должны быть совмещены во времени и выполняться одновременно.

Параллельность достигается при выполнении работ несколькими инструментами или на нескольких рабочих местах одновременно. Соблюдение принципа параллельности ведет к сокращению длительности биотехнологического производственного цикла, к экономии рабочего времени на данных предприятиях.

Принцип ритмичности означает, что все отдельные биотехнологические производственные процессы и единый процесс производства биотехнологической продукции повторяются через установленные периоды времени.

Принцип непрерывности реализуется в таких формах организации биотехнологического производственного процесса, при которых все его операции осуществляются непрерывно, без перебоев, и все предметы труда непрерывно движутся с операции на операцию. Полностью принцип непрерывности биотехнологического производственного процесса реализуется на автоматических и непрерывно-поточных линиях, на которых изготавливаются и собираются предметы труда, имеющие операции одинаковой или кратной такту линии продолжительности. Реализация принципа непрерывности работы требует ликвидации либо минимизации перерывов. Решение такой задачи может быть достигнуто на основе соблюдения принципов пропорциональности и ритмичности. Нарушение принципа непрерывности, как правило, вызывает перебои в работе (простои рабочих и оборудования), ведет к увеличению длительности биотехнологического производственного цикла и размера незавершенного производства биотехнологической продукции.

Приведенные выше принципы организации биотехнологического производства на практике действуют не изолировано, они тесно переплетаются в каждом производственном процессе. Степень реализации принципов организации имеет количественное измерение, поэтому в дополнение к действующим методам анализа биотехнологического производства должны разрабатываться и применяться на практике формы и методы анализа состояния организации биотехнологического производства и реализации ее научных принципов. Соблюдение принципов организации биотехнологических производственных процессов на предприятиях имеет большое практическое значение. Проведение в жизнь этих принципов является делом всех звеньев управления биотехнологическим производством.

Одна из основных научных задач промышленной биотехнологии - интенсификация биопроцессов как за счет повышения потенциала биологических агентов и их систем, так и за счет усовершенствования оборудования, применения биокатализаторов (иммобилизованных ферментов и клеток) в промышленности, аналитической химии, агросекторе.

При разработке биотехнологического процесса обычно ставятся две достаточно различающихся цели:

1. Получение продукта, для которого биотехнологический способ является единственно возможным, либо более оправданным в силу различных причин;

2. Получение продуктов с более высокой добавленной стоимостью при переработке сырьевых ресурсов.

Первая цель достигается при реализации концепции cell factory, когда организм изменяется таким образом, что синтез целевого продукта либо существенно повышается по сравнению с природным (например, при получении продуцентов антибиотиков), либо создается с использованием методов генной и\или метаболической инженерии. Типичными примерами могут служить процессы получения терапевтических рекомбинантных белков в различных живых системах – бактериальных клетках, клетках млекопитающих и других. При этом используется весь набор современных методов молекулярной биологии, генетики, генной и метаболической инженерии, микробиологии, биохимии.

Во втором случае доминантой является максимально эффективное использование сырьевых ресурсов (концепция biorefinery). Одной и основных тенденций служит комплексная переработка возобновляемого растительного сырья, в частности, зерна. При этом часть продуктов переработки имеет собственную высокую ценность (глютен), а часть служит сырьем для дальнейшего процессинга (крахмал, гемицеллюлозы). Здесь главная задача состоит в создании процессов, обеспечивающих возможно более высокую степень конверсии сырья в целевой продукт, а также утилизацию образующихся отходов.

Примером такого рода процесса может служить производство органических растворителей (бутанол и ацетон) с разделением образующихся водорода и углекислого газа и их реализацией и выращиванием кормовых дрожжей, обогащенных витаминами на остатке питательной среды после ферментации. В результате производство становится полностью безотходным.

Исходя из двух указанных концепций, очевидны основные направления исследований и развития технологий. В первую очередь это использование метаболической инженерии для исключения метаболических путей, ведущих к образованию нецелевых продуктов. Далее, перенос гетерологичных генов и их комплексов в организмы, физиологически более приспособленные к утилизации доступных видов сырья, либо более удобные с технологической точки зрения.

Работы такого рода ведутся и уже есть очень впечатляющие достижения. В частности, за рубежом идет освоение биосинтетического способа получения изопрена, что означает революцию в резиновой промышленности.

Не менее важной задачей в развитии промышленной биотехнологии является создание экономичных и эффективных способов выделения и очистки продуктов биосинтеза. Очевидно, что в ближайшее время следует ожидать серьезных достижений в использовании мембранных технологий.

Таким образом, одновременность снижения доступности невозобновляемых ресурсов и повышения эффективности биотехнологических процессов неминуемо приведет к взрывному росту востребованности биопроцессов.

В качестве источников сырья для биотехнологии все большее значение будут приобретать воспроизводимые ресурсы не пищевых растительных материалов, отходов сельского хозяйства, которые служат дополнительным источником как кормовых веществ, так и вторичного топлива (биогаза), органических удобрений.

Одной из бурно развивающихся отраслей биотехнологии считается технология микробного синтеза ценных для человека веществ. По прогнозам, дальнейшее развитие этой отрасли повлечет за собой перераспределение ролей растениеводства и животноводства с одной стороны, и микробного синтеза - с другой, в формировании продовольственной базы человечества.

Не менее важным аспектом современной микробиологической технологии является изучения участия микроорганизмов в биосферных процессах и направленная регуляция их жизнедеятельности с целью решения проблемы охраны окружающей среды от техногенных, сельскохозяйственных и бытовых загрязнений.

С этой проблемой тесно связаны исследования по выявлению роли микроорганизмов в плодородии почв (гумусообразовании и пополнении запасов биологического азота), борьбе с вредителями и болезнями сельскохозяйственных культур, утилизации пестицидов и др. химических соединений в почве. Имеющиеся в этой области знания свидетельствуют о том, что изменение стратегии хозяйственной деятельности человека от химизации к биологизации земледелия оправдывается как с экономической, так и с экологической точек зрения. В данном направлении перед биотехнологией может быть поставлена цель регенерации ландшафтов.

Ведутся работы по созданию биополимеров, которые будут способны заменить современные пластмассы. Эти биополимеры имеют существенное преимущество перед традиционными материалами, так как нетоксичны и подвержены биодеградации, то есть легко разлагаются после их использования, не загрязняя окружающую среду.

Биотехнологии, основанные на достижениях микробиологии, наиболее экономически эффективны при комплексном их применении и создании безотходных производств, не нарушающих экологического равновесия. Их развитие позволит создавать все новые инновационные продукты и оптимизировать экономику все производственных процессов.

6.2. Большое разнообразие биотехнологических процессов, нашедших промышленное применение, приводит к необходимости рассмотреть общие, наиболее важные проблемы, возникающие при создании любого биотехнологического производства. Процессы промышленной биотехнологии разделяют на две большие группы: производство биомассы и получение продуктов метаболизма. Однако такая классификация не отражает наиболее существенных с технологической точки зрения аспектов промышленных биотехнологических процессов. В этом плане необходимо рассматривать стадии биотехнологического производства, их сходство и различие в зависимости от конечной цели биотехнологического процесса. В общем виде система биотехнологического производства продуктов микробного синтеза представлена на рисунке 1. 

Следует отметить, что существует пять стадий биотехнологического производства. Две начальные стадии включают подготовку сырья и биологически действующего начала. В процессах инженерной энзимологии они обычно состоят из приготовления раствора субстрата с заданными свойствами (рН, температура, концентрация) и подготовки партии ферментного препарата данного типа, ферментного или иммобилизованного.

При осуществлении микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента – главная задача любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами.

Рисунок 1 – Система биотехнологического производства

Третья стадия – стадия ферментации, на которой происходит образование целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит.

На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях, весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции.

Заключительная стадия биотехнологического производства - приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Кроме того, препараты для медицинских целей требуют специальных решений на стадии расфасовки и укупорки, так должны быть стерильными. Далее приводится характеристики каждой из стадий промышленного микробиологического синтеза.

6.3. Главным объектом биотехнологического процесса является клетка. В ней синтезируется целевой продукт. По сути, клетка представляет собой миниатюр­ный химический завод, где ежеминутно синтезируются сотни сложнейших со­единений.

Основа современного биотехнологического производства – синтез различных веществ с помощью клеток микроорганизмов. Клетки высших растений и животных еще не нашли широкого применения, ввиду их высокой требовательности к условиям культивирования.

Начальным этапом биотехнологической разработки является получе­ние чистых культур клеток и тканей. Дальнейшие манипуляции с этими куль­турами характеризуется единообразием подходов, основанных на классических методах микробиологии. При этом культуры клеток и тканей высших растений и животных уподобляются культурам микроорганизмов.

Подбор форм микроорганизмов с заданными свойствами. Подбор необходимых для культивирования форм микроорганизмов с за­данными свойствами включает несколько этапов.

1. Выделение микроорганизмов. Отбираются пробы из мест обитания микроорганизмов (почва, растительные остатки и т.д.). Применительно к углеводородокисляющим микроорганизмам таким местом может быть почва возле бензоколонок, винные дрожжи обильно встречаются на винограде, анаэробные целлюлозаразлагающие и метанобразующие микроорганизмы в больших количест­вах обитают в рубце жвачных животных.

2. Получение накопительных культур. Образцы вносят в жидкие питательные среды специального состава, создают благоприятные условия для развития продуцента (температура, РН, источники энергии, углерода, азота и т.д.). Для накопления продуцента холестериноксидазы используют среды с холестерином в качестве единственного источника углерода; углеводородокисляющих микроор­ганизмов - среды с парафинами; продуцентов протеолитических или липолитических ферментов - среды, содержащие белки или липиды.

3. Выделение чистых культур. На плотные питательные среды засевают образцы проб из накопительных культур. Отдельные клетки микроорганизмов на плотных питательных средах образуют изолированные колонии или клоны, при их пересеве получаются чистые культуры, состоящие из клеток одного вида про­дуцента.

Другой путь подбора микроорганизмов - из имеющихся коллекций. Например, продуцентами антибиотиков чаще являются актиномицеты, этанола – дрожжи.

Клон - культура, полученная из одной клетки, чистая культура - сово­купность особей одного вида микроорганизмов, штаммы - культуры, выделен­ные из различных природных сред или из одной среды в разное время.

4. Определение способности синтезировать целевой продукт - главный критерий при отборе продуцентов. Микроорганизмы должны соответство­вать следующим требованиям:

1) обладать высокой скоростью роста;

2) использовать для жизнедеятельности дешевые субстраты;

3) быть устойчивыми к заражению посторонней микрофлорой.

Одноклеточные организмы характеризуются более высокими скоростями синтетических процессов, чем высшие растения и животные. Так, корова массой 500 кг в течение одних суток синтезирует около 0,5 кг белка. Такое же количест­во белка за одни сутки можно получить с помощью 5 г дрожжей. Интерес пред­ставляют фотосинтезирующие микроорганизмы, использующие энергию света, способные к усвоению атмосферного азота. Выгодны термофильные микроорга­низмы. Их использование снижает дополнительные затраты на стерилизацию промышленного оборудования. Скорость роста и обмен веществ у этих организмов в 1,5-2 раза выше, чем у мезофилов. Синтезирующие ими ферменты устой­чивы к нагреванию, действию кислот, органических растворителей.

Биотехнологические процессы воспроизводства микроорганизмов могут быть основаны на периодическом или непрерывном культивировании.

Биореактор, ферментер или ферментатор – это закрытая или открыта емкость, в которой при определенных условиях (давление, температура, концен­трация сухих веществ, рН среды и т.д.) протекает на клеточном или молекуляр­ном уровне контролируемая реакция, осуществляемая с помощью микроорганиз­мов. Ферментация проходит в специальных емкостях, называемых ферментерами или биореакторами. Конструкция биореактора приведена на рисунке 2.

Рисунок 2 – Устройство ферментера

Основными элементами ферментера являются двойные стенки, промежуток между которыми заполняется охлаждающей или нагревающей жидкостью, входные отверстия для газовых и жидких потоков, система контроля за составом питательной среды и условиями внутри реактора.

Периодический процесс включает:

а) стерилизацию сред, биореакторов и вспомогательного оборудования;

б) загрузку аппарата питательной средой;

в) внесение посевного материала (клеток, спор);

г) рост культуры, который может совпадать во времени со следующим этапом или предшествовать ему;

д) синтез целевого продукта;

е) отделение и очистку готового продукта.

Речь идет о вре­менной последовательности этапов, по окончании последнего этапа проводится мойка биореактора и его подготовка к новому циклу.

Этап роста культуры включает несколько фаз:

а) лаг-фазу – сравнительно медленный рост внесенной культуры, осваивающей новую среду обитания в объ­еме биореактора;

б) экспоненциальную фазу – бурное деление клеток, сбалан­сированный рост культуры;

в) фазу замедленного роста, связанного с исчерпа­нием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболиз­ма;

г) стационарную фазу – прирост клеток равен их убыли;

д) фазу отмирания – постепенное снижение числа жизнеспособных клеток.

Биотехнологически ценные продукты синтезируются в экспоненциальную фазу (нуклеотиды, многие ферменты, витамины – так называемые первичные метаболиты) или в стационарную фазу роста (антибиотики, красящие вещества и т.д. — так называемые вторичные метаболиты или идиолиты).

Широко применяют периодическое культивирование с подпиткой: по­мимо внесения питательного субстрата в реактор до введения в него биообъекта, в процессе культивирования в аппарат добавляют питательные вещества через определенные промежутки времени порциями или непрерывно «по каплям». Иногда дополнительно вносят биообъект.

Существует также отьемнодоливочное культивирование, когда часть объема из биореактора время от времени изымается при добавлении эквивалент­ною объема среды. Это приводит к регулярному омолаживанию культуры и к за­держке ее перехода к фазе отмирания. Такой режим культивирования в значи­тельной мере уподобляется непрерывному процессу, поэтому называется также полунепрерывным культивированием.

В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экс­поненциальной фазе роста. Обеспечивается непрерывный приток свежей пита­тельной среды в биореактор и отток из него культуральной жидкости, содержа­щей клетки и продукты их жизнедеятельности. Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой. Различают хемостатный и турбидостатный режимы не­прерывного культивирования.

 Глубинный метод культивирования заключается в выращивании микроорганизмов в жидкой питательной среде. Он технически более соверше­нен, чем поверхностный, так как легко поддается механизации и автоматизации.

Весь процесс должен проводиться в строго асептических условиях, что с одной стороны, является преимуществом метода, а с другой – составляет наи­большую техническую трудность, т.к. нарушение асептики часто приводит к прекращению образования фермента.

Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обыч­но значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Фильт­раты культуральных жидкостей содержат не более 3% сухих веществ. Это вызы­вает необходимость предварительного концентрирования фильтратов перед тем, как выделять ферменты любым методом.

  Поверхностный метод культивирования продуцентов ферментов. Культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и прочно скрепляет твердые части­цы, клетки получают питание за счет содержащихся в этих средах веществ и ис­пользуют для дыхания кислород воздуха, поэтому для их нормального обеспече­ния кислородом приходится применять рыхлые по своей структуре среды с не­большой высотой слоя.

Недостатком метода является необходимость больших площадей для вы­ращивания. Выращивание производственной культуры происходит обычно в не­асептических условиях. Однако среда и кюветы должны быть надежно стерили­зованы. Перед новой загрузкой должны дезинфицироваться растильные камеры, а также все мелкое оборудование и инвентарь.

Главное преимущество поверхностного метода - более высокая конечная концентрация фермента на единицу массы среды. Например, для осахаривания 100 кг крахмала в спиртовом производстве требуется 5 кг поверхностной культу­ры плесневых грибов или около 100 кг культуральной жидкости. Поверхностные культуры можно быстро и легко высушить, их легко перевести в товарную фор­му и транспортировать. Меньше потребность электроэнергии по сравнению с глубинным методом.

 Рассмотрим системы культивирования микроорганизмов. Культивирование микроорганизмов может осуществляться в откры­той или закрытой системе.

Система называется закрытой, если ни одна составная часть этой систе­мы после начала процесса в биореакторе не вводится и не выводится. В периоди­ческом процессе в ферментер сначала подают все питательные вещества, водную фазу и посевной материал. Процесс идет в соответствии с кривой роста микроор­ганизмов с заключительным замиранием реакции, обусловленным недостатком субстрата, накоплением токсических метаболитов, неблагоприятным изменением физико-химических условий окружающей среды (рН, температура, парциальное давление кислорода, вязкость), гибелью и лизисом микроорганизмов. Во время культивирования все параметры непрерывно изменяются.

Развитие управляемых периодических процессов привело к созданию объемно-доливочной системы: в процессе культивирования главные компоненты среды добавляют дробно, чем исключают субстратное ингибирование. Никакие жидкие компоненты из среды не отводят.

Открытые системы работают в непрерывном потоке. В процессе реакции часть отработанной питательной среды из биореактора удаляют и добавляют новую, что обеспечивает непрерывность процесса. В единицу времени субстрата вводят не больше, чем может переработать культу­ра. Проводят непрерывное культивирование по крайней мере с одной лимити­рующей рост концентрацией вещества. Регулирование осуществляют поддержа­нием концентрации биомассы или продукта на постоянном уровне путем измене­ния концентрации субстрата (турбидостат) или применения строго лимитиро­ванной концентрации питательных веществ с соответствующим изменением кон­центрации клеток или продукта (хемостат).

При получении микробных белковых препаратов часто применяют непре­рывное культивирование как более экономичное и легче контролируемое. Кон­центрация питательных веществ вокруг клетки должна лежать в пределах допус­тимой области и не способствовать течению побочных реакций, которые могут привести к образованию осадков, осаждающихся и на стенках ферментера.

6.4. Методы хранения посевного материала. При промышленном культивировании клеток в биореакторах идет про­цесс постепенного вытеснения менее приспособленных форм более приспособ­ленными, часто менее продуктивными по отношению к вырабатываемым веще­ствам. Он получил название автоселекции. В связи с этим встает проблема длительного хранения клеток без утраты ценных свойств. Это возможно, если резко затормозить все протекающие в них жизненные процессы. Существуют следую­щие методы хранения.

1. Лиофильное высушивание (обезвоживание после замораживания при температуре -40~60 °С и ниже) применяется в отношении продуцентов антибио­тиков:

а) Высушивание на воздухе в стерильной среде (на почве, бумаге, дис­ках агар-агара и т.д.).

б) Сохранение спор (пригоден для спорообразующих бактерий рода Вacilus).

в) Криоконсервация – глубокое замораживание клеток с их последующим хранением в жидком азоте (- 196 °С) или в парах азота ( - 155 °С).

Значительные трудности представляет поддержание сред, оборудования, воздуха в стерильном состоянии. Это необходимо для исключения попадания в биоректоры посторонних микроорганизмов.

Клетки лучше сохраняют свои свойства при создании щадящих условий в биореакторе, приближенных к условиям в лабораторном культиваторе.

2. Выделение целевого продукта. Это завершающая стадия биотехнологического процесса. Продукт может накапливаться в клетке или выделятся в культуральную жидкость. Наибо­лее сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках. Для этого клетки необходимо отделить от культуральной жидкости, разрушить, затем целевой продукт очистить от массы компонентов разрушенных клеток.

Первым этапом на пути к очистке целевого продукта является отделение биомассы от культуральной жидкости - сепарация.

Виды сепарации:

1. Флотация. Если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой смачи­ваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости, то жидкость предва­рительно вспенивают, затем отделяют ее верхний слой с клетками. Флотаторы различных конструкций сцеживают, откачивают или соскребают пену, состоя­щую из пузырьков газа с прилипшими к ним клетками. Флотацию широко ис­пользуют как первый этап отделения дрожжевой массы для осветления культу­ральной жидкости.

2. Фильтрация - задержание биомассы на пористой фильтрующей пе­регородке. Применяют фильтры однократного или многократно использования: барабанные, дисковые, ленточные, тарельчатые, карусельные, вакуум-фильтры, фильтр-прессы различных конструкций, мембранные фильтры. Диаметр пор мо­жет превышать размеры клеток. Иногда биомассу сдувают с поверхности фильт­ра сжатым воздухом или срезают специальным ножом.

3. Центрифугирование - осаждение взвешенных в жидкости частиц с применением центробежной силы. Требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование. Поэтому оно оправдывает себя, если: а) суспензия фильтрует­ся медленно; б) поставлена задача максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся частиц; в) необходимо наладить непрерывный про­цесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодическое действие.

Центрифугирование и фильтрация иногда реализуются в комбинации, в фильтрационных центрифугах. Перспективны для осаждения биомассы центрифуги-сеператоры, в которых биомасса оседает на стенках вращаемого цилиндра или на тарелках специальной тарельчатой вставки.

Вторым этапом при получении продукта, накапливающегося в клет­ках, является разрушение клеток, которое проводят физическим, химическим и химико-ферментативным методами.

Физическое разрушение проводят ультразвуком, с помощью вращаю­щихся лопастей или вибраторов, встряхиванием со стеклянными бусами, продавливанием под высоким давлением через узкое отверстие, раздавливанием замо­роженной массы, растиранием в струнке, осмотическим шоком, замораживанием - оттаиванием, сжатием с последующим резким снижением давления. Этим спо­собам дезинтеграции клеток присуща определенная неизбирательность: обработ­ка может отрицательно влиять на качество получаемого продукта. Физические методы позволяют целенаправленно выделять какую-либо одну фракцию внут­риклеточного содержимого.

Химическое и химико-ферментативное разрушение клеток избира­тельно, не всегда пригодно. Его проводят обработкой клеток толуолом или бутанолом при промышленном получении дрожжевого автолизата и ряда ферментов. Эффективный лизис клеток вызывают антибио­тики полимиксины, тироцидины. новобиоцин, нистатин и другие, некоторые по­верхностно-активные вещества, а также глицин.

Разрушенные клеточные стенки отделяют методами сепарации. В боль­шинстве биотехнологических процессов клеточные стенки отбрасывают как бал­ласт, но возможно и промышленное получение компонентов клеточных стенок как целевого продукта.

Третий этап - выделение целевого продукта из культуральной жидко­сти или гомогената разрушенных кислот проводят путем его осаждения, экстрак­ции или адсорбции.

1. Осаждение растворенных веществ возможно физическими (нагрева­ние, охлаждение, разбавление или концентрирование раствора) или химическими методами, переводящими отделяемый продукт в малорастворимое состояние. Так, пенициллин переводят в кристаллический осадок в присутствии соединений калия или натрия. Белки осаждают добавлением сульфата аммония, органических растворителей (этанола, ацетона). Нуклеиновые кислоты осаждают с помощью полииминов, основные группы которых вступают во взаимодействие с их фосфатными группами. Современной модификацией метода является аффинное осаждение.

2. Экстракция извлечение продукта из твердого (твердо-жидкофазная) или жидкого (жидко-жидкофазная) образца. К твердо-жидкофазной экстракции относится обливание образца водой с целью извлече­ния из него растворимых веществ, например солей металлов из руд, подвергну­тых бактериальной обработке, или растворимых продуктов из массы субстрата (соломы и т.д.) при твердофазном культивировании. Применяют органические растворители, например, при экстракции клеточной массы ацетоном, переводя­щим в раствор ряд липидных и белковых компонентов.

Жидко-жидкофазная экстракция - добавление органических растворите­лей для извлечения из культуральной жидкости антибиотиков, витаминов, каратиноидов, липидов, некоторых гидрофобных белков. Витамин В12 экстрагируют фенолом и его производными (крезол, другие алкилфенолы, галогениды). Исполь­зуют бензиловый спирт, особенно в щелочных условиях. Фосфолипиды извлека­ют путем экстракции хлороформом.

Полностью избежать нагревания, губительного для многих ценных ве­ществ, позволяют методы холодовой экстракции (криоэкстракции). Она как бы нивелирует различие между твердым субстратом и культуральной жидкостью, поскольку и то и другое находится в замороженном состоянии. Криоэкстракция осуществляется растворителями, кипящими при низких температурах и находя­щимися при комнатной температуре в газообразном состоянии. Криоэкстракция может использоваться в комбинации с криоконсервацией клеток. Урожай клеток длительное время хранится без потери свойств в условиях глубокого заморажи­вания.

3. Адсорбция - частный случай экстракции, при котором экстрагирую­щим веществом из жидкой или газовой фазы является твердое тело. Хорошими адсорбентами являются древесный уголь, глины с развитой пористой поверхно­стью. Путем адсорбции из культуральной жидкости выделяют антибиотики и ви­тамины.

К современным методам разделения веществ, основанным на принципах экстракции и адсорбции, относятся хроматография, электрофорез, изотахофорез, электрофокусировка.

 

6.5. Если мембрана пропускает воду, задерживая растворенные в ней вещест­ва, речь идет об осмосе. Ультрафильтрация – отделение веществ с помощью мембранных фильтров.

Наиболее древний метод – выпаривание. Его недостаток состоит в не­обходимости нагревания, которое проводят при низком давлении. Используют вакуум-выпарные аппараты. Нагревающим агентом чаще всего служит водяной пар, хотя используют также обогрев жидким теплоносителем или электрообогрев. Пар характеризуется большой теплотой конденсации и облегчает регулиров­ку процесса выпаривания.

Обезвоживание продукта – сушка на подносах, на ленточном конвейере с подогревом, подачей газообразного нагревательного агента (воздух, СО2, ды­мовые или топочные газы и др.) в сушильный аппарат, в вакуум – сушильных шкафах, в барабанных и распылительных сушилках.

Модификация продукта - перестройка полученных соединений живот­ного, растительного или микробного происхождения с целью придания им спе­цифических свойств, необходимых человеку. Химическая модификация необхо­дима в тех случаях, когда биотехнологический процесс дает лишь «заготовку» целевого продукта.

Модификация - необходимый этап в получении ряда ферментов, гормо­нов, препаратов медицинского назначения. Например, у бычьего инсулина «от­стригают» аминокислотные остатки, после чего он становится идентичным чело­веческому гормону.

Стабилизация продукта направлена на сохранение свойств продукта в период его хранения и использования потребителем (добавление наполнителей, модификация и др.). Включает физико-химические воздействия на продукт Сушка повышает устойчивость продукта к внешним воздействиям. Обезвожива­ние ферментов вызывает их устойчивость к нагреванию.

К стабилизации продуктов, в том числе кормового микробного белка, ве­дет добавление наполнителей из грибного мицелия, пшеничных отрубей, куку­рузной муки, которые сами обладают питательной ценностью.

6.6. Все товарные формы биопрепаратов с точки зрения технологии их получения можно разделить на три основные группы.

1. Биопрепараты, имеющие в товарном продукте в качестве основного компонента жизнеспособные микроорганизмы. К этой группе относятся средства защиты растений, бактериальные удобрения, закваски для силосования кормов, биодеграданты, другие активные средства биотрансформации.

2. Биопрепараты, в состав которых входит инактивированная биомасса клеток и продукты ее переработки. Это кормовые дрожжи, грибной мицелий и т.д.

3. Биопрепараты на основе очищенных продуктов метаболизма микроорганизмов. К ним относятся витамины, аминокислоты, ферменты, антибиотики, биолипиды, полисахариды, продукты комплексной переработки микробных масс и метаболитов.

В зависимости от принятых на предыдущей стадии решения товарные формы представляют собой либо сложную смесь, содержащую некоторое количество основного вещества, либо высокоочищенный препарат, отвечающий ряду специальных требований.

Продукт может выпускаться в жидком (например жидкий концентрат лизина) или сухом виде (белково-витаминный концентрат, энтомопатогенные препараты, кормовой концентрат лизина). Стадия фасовки рассмотренных комплексных препаратов заключается в помещении их в тару (мешки, барабаны и т.п.), размеры и тип которой определяются потребностями заказчика и свойствами продукта (его слеживаемостью, гигроскопичностью, стойкостью к загниванию и т.д.). Другие требования предъявляются к медицинским препаратам и биохимическим реактивам.