Синтез генов

Впервые химический синтез гена осуществил в 1969 г. работающий в США индийский ученый Х.Г.Корана с сотрудниками. Он синтезировал ген (участок молекулы ДНК), кодирующий синтез аланиновой т-РНК пекарских дрожжей. Этот ген состоял из 77 пар нуклеотидов, последовательность которых была известна.

Вначале синтезировали мелкие фрагменты ДНК, содержащие от 4 до 13 нуклеотидных пар, затем с помощью фермента лигазы их соединили в соответствующем порядке, но данный ген был не в состоянии синтезировать аланиновую т-РНК, так как не содержал акцепторной системы.

В 1976 г. в лаборатории Х.Г.Кораны был синтезирован фрагмент су-прессорной тирозиновой т-РНК длиной 126 пар нуклеотидов, промотор,

состоящий из 52 пар нуклеотидов, и терминатор, имеющий 21 пару нуклеотидов.

К концам молекулы ДНК были прикреплены так называемые "липкие концы", состоящие из чередования нуклеотидов ААТТ (один конец) и ТТАА (другой конец). Благодаря этому данный ген был встроен в геном фага и нормально в нем фун кционировал .Таки м образом, была показана возможность искусственного синтеза генов. Метод позволяет синтезировать относительно мелкие гены, содержащие небольшое число пар нуклеотидов.

Ферментативный синтез. Гены, кодирующие ферменты или структурные белки, состоящие из тысячи и более нуклеотидных пар, рациональнее создавать методом ферментативного синтеза с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы). С помощью данного фермента с м-РНК могут быть получены точные копии ДНК (кДНК).

Ферментативный синтез может быть схематично представлен следующим образом. В пробирку, содержащую физиологическую бесклеточную среду, вносят нуклеозиды всех четырех типов (А, Г, Т, Ц), фермент ревертазу, м-РНК, кодированную природным геном, копию которого планируется получить.

В качестве "затравки" ускоряющей реакцию, вносят небольшие участки молекулы ДНК, содержащие 8-10 повторов тимина (короткие одно-цепочные олигонуклеотиды). Они будут образовывать по принципу ком-плементарности двуцепочные ДНК-РНК-фрагменты, которые будут служить затравкой для начала ферментативной реакции.

Второй закон Меделя

При самоопылении растений первого гибридного поколения (Р,) во втором поколении наблюдается растепление по фенотипу. При этом отношение числа особей с доминантным признаком к числу особей с рецессивным в Р₂ составляет 3:1. Опи-санный феномен носит название «закона расщепления». Черточка, стоящая справа отдоминантного аллеля А_ означает, что вторым в данном генотипе может бьпъ как доминантный (А), так и рецессивный (а) аллель. Часть формулы генотипа, которая обусловливает развитие признака, называется фенотипическим радикалом. Закон расщепления можно сформулировать и так: у потомков гибридов первого поколенияв моногибридных скрещиваниях отношение доминантных признаков к рецессивным равно 3:1.

Мендель не просто подсчитал соотношение фенотипических классов при расщеплении, но и высказал предположение, что в его основе лежит сочетание двух факторов: равновероятного образования гамет А и а у гибридов Аа первого поколения и равновероятной встречи гамет обоих типов при оплодотворении. Сам Мендель под-черкивал, что открытые им закономерности носят чисто статистический характер идля их подтверждения необходимы большие выборки экспериментального материала.

В современных исследованиях для того, чтобы оценить значимость наблюдаемого отклонения от теоретически ожидаемого результата, обычно используют метод х-квадрат. Применив этот метод к данным, представленным в табл. 1.2, можно убедиться, что наблюдаемые в опытах Менделя незначительные отклонения от ожидаемого соотношения недостоверными.

Впервые выделить ген методом трансдукции удалось ДжБексвиту с сотрудниками. Они показали, что бактериофаг X при размножении в клеткеЕ.СоЫ может захватить и встроить в свой геном полный лактозный оперон бактерии вместе с примыкающим к нему геном-регулятором.

Фрагмент ДНК E.Coli встраивается в геном фага X в строгом порядке: структурные гены, оператор, промотор и регулятор. Применениемденатурации и центрифугирования из ДНК-фага был выделен лактозный оперон и ген-регулятор E.Coli.

ДНК-зонд — одноцепочечная ДНК, длиной до 30 нуклеотидов, используемая для поиска комплементарных последовательностей в молекуле большего размера или среди множества разнообразных молекул ДНК. ДНК-зонды можно синтезировать искусственно либо выделить из генома. Затем эти последовательности клонируют, чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неограниченном количестве.

Блот-гибридизация. Это высокочувствительный метод идентификации специфических последовательностей ДН К, Денатурированные фрагметы ДНК переносят на плотный носитель - нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану. Далее фиксированную на этом носителе ДНК гибридизуют с радиоактивно меченным ДНК- или РНК-зондом. Затем положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме определяют методом радиоавтографии. 

Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. После удаления не связавшихся молекул ДНК и специфической обработки, в зависимости от типа использованного зонда, места хромосомной локализации последовательностей ДНК, комплементарных соответствующим ДНК-зондам, наблюдают в микроскоп в виде характерных светящихся точек. Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Суть метода в специфич аплиф ДНК с пом полимеразы, осущ избират синтез взаимнокомпл цепей ДНК, начин с двух праймеров. Прайм компл противопол цепям ДНК в участках, огранич выбранную обл ДНК, и оринтир 3-концами навчтречу друг другу и в сторону той послед, кот необх амплифицир. Длина ампл фрагм опред расст между праймерами. Исп в кач матр любые образцы ДНК, содерж ампилфицируемую послед, можно увелич число копий изуч фрагмента в млн раз. Цикл из 3 этапов: 1)денатурация (плавл) двухцепоч структ путем нагр до 94С 2) ренатурац или гибридизац комплемент участков ДНК с прайм при 37-68С 3)синтез послед, компл матр ДНК при 72С

Генети́ческий код — свойственный всем живым организмам способкодирования аминокислотной последовательности белков при помощи последовательности нуклеотидов.

В ДНК используется четыре азотистых основания — аденин (А), гуанин (G),цитозин (С), тимин (T), которые в русскоязычной литературе обозначаются буквами А, Г, Ц и Т. Эти буквы составляют алфавит генетического кода. ВРНК используются те же нуклеотиды, за исключением тимина, который заменён похожим нуклеотидом — урацилом, который обозначается буквойU (У в русскоязычной литературе). В молекулах ДНК и РНК нуклеотидывыстраиваются в цепочки и, таким образом, получаются последовательности генетических букв.Триплетность — значащей единицей кода является сочетание трёх нуклеотидов (триплет, или кодон). Непрерывность — между триплетами нет знаков препинания, то есть информация считывается непрерывно. Неперекрываемость — один и тот же нуклеотид не может входить одновременно в состав двух или более триплетов (не соблюдается для некоторых перекрывающихся генов вирусов, митохондрий ибактерий, которые кодируют несколько белков, считывающихся со сдвигом рамки). Однозначность (специфичность) — определённый кодон соответствует только одной аминокислоте (однако, кодон UGA уEuplotes crassus кодирует две аминокислоты — цистеин иселеноцистеин)^[1] Вырожденность (избыточность) — одной и той же аминокислоте может соответствовать несколько кодонов.

Универсальность — генетический код работает одинаково в организмах разного уровня сложности — от вирусов до человека Помехоустойчивость — мутации замен нуклеотидов, не приводящие к смене класса кодируемой аминокислоты, называютконсервативными; мутации замен нуклеотидов, приводящие к смене класса кодируемой аминокислоты, называют радикальными.

Генетическое картирование –опр группы сцепл и пол карт гена относ др генов данной хром. 1 этап карт опр принадл гена к той или онй гр сцепл. Для локал мутац необх располагать набором марк генов для кажд хром. Картир мутац основ на анал ее сцепл с этими марк. Скрещ пров до тех пор, пока не удается выяв сцепл наслед анал мут с марк мутациями какой-то хром. 2 этап – опр поло гена в хром. Подсч расст межд иссл геном и маркерными генами. Пров скрещ, в потом учит крос и некрос особ. Расст межд генами проп частоте крос межд ними. Дальше гены –частая рекомб, до 50%, имитир независ наслед. При сост карт межд дал расп генами исп не подсчеткрос особ, а слож расст межд многими близко расп генами, нах внутри изуч протяженного участка. В этом случае сцепл межд далеко расп генами можно установ по сцепл насл с промежут-распол генами, кот в свою очередь сцепл между собой. В рез-те расст между ген длины карт хром могут превыш 50 морганид.

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ КАРТЫ

Этот метод основан на использовании хромосомных перестроек. При облучении и действии др. мутагенов в хром часто наблюд потери (делеции) или вставки (дупликации) небольших фрагментов, велич в один или неск локусов. Напр, можно исп гетерозиготи по хром. одна из которых будет нести группу следующих друг за другом дом алл, а гомологичная ей - группу рецессивных аллелей тех же генов АВСДЕ/абсде. Если в хром с дом генами произошла утрата отдельных генов,напр ДЕ, то у гетеро АВС/аЬсде будут проявляться рецессивные признакиде. На этом принципе основан метод перекрывающихся делеций, исп припостроении цитологических карт. Напр, у дроз составлены цитологические карты политен хром. При окраске этих хром, в тысячу раз превышающих по размерам митотические хромосомы, на препаратах выявляются темно-окраш диски и светлые участки - междиски. При этом каждая хромо имеет свой индивид рисунок чередования разл дисков (толстых, тонких,пунктирных) и междисков, что позв отл одну хром от др и ранные участки одной хромосомы. На полигонных хромосомах можно четко определятьконцы делеций. Цит карты можно сост с пом использ транслокац и инверсий Первые цит карты хром дроз сост Добжансикм.