Завдання 2. Дослідити функціонування цтк мітохондрій за швидкістю утворення со2 та вплив малонової кислота на цей процес.

Принцип методу. Перетворення ацетил-S-КоА в присутності мітохондрій, що містять ферменти ЦТК, супроводжується утворенням СО₂. В якості джерела ацетил-S-КоА, що вступає в ЦТК, використовують піровиноградну кислоту (ПВК). ПВК під дією мультиферментного піруват-дегідрогеназного комплексу мітохондрій піддається окисному декарбоксилуванню з утворенням ацетил-S-КоА.

Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), то СО₂не утворюється і бульбашки газу не виділяються. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (янтарної кислоти).

Для зв’язування СО₂, що утворюється, в інкубаційне середовище додають Са(ОН)₂. Після закінчення інкубації, зв’язаний СО₂ визначають по виділенню бульбашок газу, що утворюються після додавання до інкубаційного середовища сірчаної кислоти.

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок	Пробірки
	Контроль	Дослід №1	Дослід №2
Фосфатний буфер, рН = 7,4	2,0 мл	2,0 мл	2,0 мл
Розчин пірувату натрію	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Малонова кислота	---	---	0,5 мл
Фізіологічний розчин №2	0,5 мл	0,5 мл	---
Розчин Са(ОН)2	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Суспензія мітохондрій	---	0,5 мл	0,5 мл
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння	0,5 мл	---	---
Інкубація в термостаті: 15 хв. при температурі 37оС
0,1 М розчин H2SO4	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл
Результати: виділення бульбашок СО2

Всі пробірки поміщають в термостат на 15 хв. при 37^оС. Після інкубації в кожну пробірку додають по 1,0мл 0,1М розчину H₂SO₄ і спостерігають за вивільненням бульбашок СО₂.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Завдання 3. Дослідити функціонування цтк мітохондрій за швидкістю утворення атомів водню та вплив малонової кислоти на цей процес.

Принцип методу. При окисленні ацетил-S-КоА в ЦТК вивільняється водень, який відновлює метиленовий синій та перетворює її в безбарвну лейкосполуку. Час, протягом якого відбувається знебарвлення розчину, є показником інтенсивності протікання ЦТК в мітохондріях.

Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), вивільнення водню не відбувається і метиленовий синій не знебарвлюється. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (янтарної кислоти).

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну №1 та дослідну №2 заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок	Пробірки
	Контроль	Дослід №1	Дослід №2
Фосфатний буфер, рН = 7,4	2,0 мл	2,0 мл	2,0 мл
Розчин пірувату натрію	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Малонова кислота	---	---	0,5 мл
Фізіологічний розчин №2	0,5 мл	0,5 мл	---
Суспензія мітохондрій	---	0,5 мл	0,5 мл
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння	0,5 мл	---	---
Метиленовий синій	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Інкубація в термостаті при температурі 37оС
Результати: час, протягом якого відбувається знебарвлення розчину

Після додавання метиленового синього всі пробірки поміщають в термостат при 37^оС і відмічають час, протягом якого відбулося знебарвлення розчину в кожній пробірці. За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК: