2.1.6.2. Методы исследования апоптоза

Методы детекции апоптоза основаны на выявлении его характерных морфологических и биохимических черт. При анализе преператов после окраски ДНК-флуорохромами ядра клеток, подвергшихся апоптотической гибели, оказываются фрагментированными, а хроматин – сильно конденсированным. Окраска аннексином-V, коньюгированным с флуорохромом, позволяет выявить экспозицию фосфатидилсерина на наружной стороне плазматической мембраны, а окраска митохондриальными красителями (например, TMRE) дает представление о падении мембранного потенциала митохондрий (обычно и то, и другое анализируют методом проточной цитофлуориметрии живых клеток с одновременным анализом проницаемости плазматической мембраны, поскольку об апоптозе свидетельствует экспозиция фосфатидилсерина и падение митохондриального потенциала в живых (непроницаемых) клетках). Фрагментацию ДНК можно выявить электрофоретически (в лизатах клеток – «лесенка» олигонуклеосомной фрагментации, или на препаратах клеток – «кометная реакция»), а также путем мечения разрывов ДНК (реакция TUNEL). Активность каспаз может быть определена по расщеплению флуорогенных субстратов в лизатах клеток или проницаемых флуорогенных субстратов в живых клетках, а также путем аффинного мечения каспаз биотинилированным необратимым ингибитором (последний метод позволяет наиболее достоверно выявить активацию конкретной каспазы последующей иммунодетекцией). Характерной чертой активации каспаз является также расщепление самих каспаз и каспазных субстратов, например белка PARP, которое можно выявлять иммуноблотом с обычными антителами, или же иммуноблотом, иммунофлуоресценцией или проточной цитофлуориметрией с использованием антител, узнающих место расщепления или изменение конформации. Дополнением к методам детекции апоптоза являются методы выявления тотальной клеточной гибели – кривые роста и оценка доли клеток с проницаемой плазматической мембраной.

2.1.6.3. Сигнальные пути регуляции апоптоза факторами роста

Как и пролиферация, апоптоз регулируется со стороны множества стимулов и сигнальных путей. Факторы роста, особенно инсулиноподобный фактор роста и PDGF, обычно ингибируют апоптоз, то есть способствуют выживанию клеток. Однако в ряде случаев, особенно при повышенной экспрессии соответствующего рецептора, ростовые факторы (в том числе EGF) способны индуцировать апоптоз. Антиапоптотическими сигнальными белками, инициируемыми рецепторами факторов роста, обычно являются PI-3 киназа, МАР-киназа ERK, STAT3. Индуктором апоптоза может быть STAT1 (Dragovich et al., 1998; Jarpe et al., 1998; Schlessinger, 2000; Danielsen, Maihle, 2002).

PI-3-киназа – наиболее важный и известный супрессор апоптоза в ответ на действие факторов роста. В большинстве случаев PI-3-киназа супрессирует апоптоз через PKB за счет инактивации Bad, активации Mdm2 – убиквитин-лигазы для проапоптотического транскрипционного фактора р53, ингибирования проапоптотических транскрипционных факторов FoxO, ингибирования проапоптотической киназы GSK-3β и особенно активации NF-κB. В свою очередь, NF-κB стимулирует экспрессию каспазных ингибиторов и белков, ингибирующих передачу проапоптотического сигнала от рецепторов семейства TNF (Datta et al., 1999; Plas, Thompson, 2005).

Через Ras и активацию ERK апоптоз может ингибироваться за счет транскрипционной индукции антиапоптотических белков семейства Bcl-2, но чаще – посредством активации экспрессии аутокринно секретируемых ростовых факторов с их последующей рецепцией и выходом на PI-3 киназный путь. В отдельных случаях возможна передача через Raf/Mek/ERK и проапоптотического сигнала (Widmann et al., 1999; Schulze et al., 2001). Ras регулирует апоптоз и за счет других путей – подавляет через PI-3 киназу или активирует через киназу Mst1 (Downward, 1997; Cox, Der, 2003).

Каскады JNK и p38 эффективно передают сигнал к активации апоптоза, но в ряде случаев активация JNK, наоборот, стимулирует выживание. Хорошо доказана роль p38 в апоптозе нейрональных клеток в отсутствие NGF за счет индуции FasL через АР-1 и NF-κB (Kyriakis, Avruch, 2001).

При повышенной экспрессии своего рецептора EGF может подавлять апоптоз за счет индукции p21^waf1, по-видимому, через ERK или STAT1, при этом одновременно снижается пролиферативная способность (Fang et al., 2000). Несмотря на то, что индукция p21^waf1 и стимуляция апоптоза часто запускаются по одним и тем же путям (например, через р53 или STAT1), p21^waf1 является антиапоптотическим белком, и уровень его индукции может определять выбор между жизнью и смертью клетки (Копнин, 2000; Evan, Littlewood, 1998).