2.1.6. Механизмы регуляции апоптоза при действии факторов роста

2.1.6.1. Апоптоз

Апоптоз (в переводе с греческого – листопад) представляет собой невоспалительный эволюционно консервативный процесс гибели клеток. Первая работа, посвященная апоптотической гибели клеток, была опубликована в 1972 году (Kerr et al., 1972), но только в 1990-х годах научное сообщество оценило важность апоптоза для функционирования тканей, органов и организмов (Yuan et al., 1993). Важным отличием апоптоза от других форм гибели клетки является то, что апоптоз в наибольшей степени регулируется со стороны сигнальных путей. Апоптоз – быстрый и достаточно безопасный для организма способ клеточной гибели в ходе эмбрионального развития, при дифференцировке иммунокомпетентных клеток, а также для элиминации инфицированных клеток, клеток, имеющих нерепарируемые повреждения ДНК, определенные мутации. Характерными чертами апоптоза являются уменьшение объема клетки (сжатие), образование вздутий на плазматической мембране (так называемый блеббинг), потеря контактов клетки с соседними клетками и с внеклеточным матриксом, приводящая к округлению, сильная конденсация хроматина, фрагментация ядра (пикноз, кариорексис), расщепление многих клеточных белков, фрагментация ДНК до олигонуклеосом, экспрессия маркеров фагоцитоза (в частности, фосфатидилсерина) на поверхности клетки. В организме апоптотические клетки фагоцитируются до того, как нарушается целостность плазматической мембраны (Strasser et al., 2000).

Наиболее важными белками, определяющими развитие апоптоза, являются каспазы (cysteine-dependent aspartate-specific proteases) – цистеиновые протеазы, разрезающие белки по последовательностям, содержащим остаток аспарагиновой кислоты. Активность каспаз приводит к расщеплению белков цитоскелета, ингибиторов ядерных ДНКаз, белков, участвующих в репликации, изменению активности регуляторов апоптоза и появлению вышеперечисленных морфологических изменений клетки (Nunez et al., 1998; Фильченков, 2003).

У млекопитающих найдено не менее 14 каспаз. Каспазы делят на три группы: активаторы апоптоза – инициаторные каспазы 2, 8, 9, 10, 12, исполнители апоптоза – эффекторные каспазы 3, 6, 7, 14, а также каспазы, участвующие в процессинге цитокинов (1, 4, 5) (Thornberry, Lazebnik, 1998). Каспазы экспрессируются в форме профермента, в структуре которого выделяют N-концевой продомен, домен большой субъединицы, линкер, ограниченный остатками аспарагиновой кислоты, и домен малой субъединицы. При расщеплении прокаспазы другой каспазой или при автопротеолизе происходит удаление продомена и линкера, а две большие и две малые субъединицы двух молекул прокаспазы образуют активный гетеротетрамер (Nunez et al, 1998).

Инициаторные каспазы имеют длинный N-концевой продомен, содержащий DED или CARD-домены для связи со специфическими активаторами. Взаимодействия с активатором приводит к димеризации прокаспазы и последующему расщеплению одной молекулы прокаспазы другой молекулой за счет базальной активности и пространственного сближения. Эффекторные каспазы имеют короткий продомен и не способны к автопроцессингу, их активация осуществляется каспазами-инициаторами. Эффекторные каспазы обеспечивают «исполнение» апоптоза – протеолиз клеточных белков (Nunez et al, 1998; Thornberry, Lazebnik, 1998; Фильченков, 2003).

Существуют 2 основных пути инициации апоптоза (рис. 8). Ряд рецепторов семейства TNF запускают через дополнительные адапторные белки активацию каспазы 8. Для этого необходимы домены рецепторов семейства TNF под названием «домены смерти» (death domains). К таким рецепторам относятся Fas/CD95 (его лиганд называется FasL/CD95L), рецептор TNF 1 (лиганд – TNFα), Apo3/DR3 (лиганд – Apo3L), DR4 и DR5 (лиганд – TRAIL/Apo2L) (Ashkenazi, Dixit, 1998) (рис. 9).

Второй путь инициации апоптоза состоит в нарушении целостности внешней мембраны митохондрий и стимуляции выхода в цитоплазму белков межмембранного пространства – Diablo/Smac, AIF, Omi/HtrA2, эндонуклеазы G, но, в первую очередь, цитохрома с. Цитохром с в цитоплазме изменяет конформацию адаптерного белка APAF-1, который после этого активирует каспазу 9 (Green, Reed, 1998; van Gurp et al., 2003). Выход цитохрома с, в свою очередь, может осуществляться двумя способами (рис. 10). Первый – образование MPT (Mitochondrial permeability transition) – ионного канала, работающего в местах соединения наружной и внутренней мембраны митохондрий. В результате функционирования MPT в матрикс закачивается вода, наружная мембрана лопается и белки межмембранного пространства выходят наружу (Kim et al., 2003). Второй, более распространенный и более изученный путь – образование белками семейства Bcl-2 поры в наружной мембране митохондрий, через кото-

Рис. 8. Основные пути индукции апоптоза (по Nuñez et al., 1998).

рую выходит цитохром с и другие белки. Активную пору образуют проапоптотические члены семейства Bcl-2 – Bax, Bak и Bok, часто при участии расщепленного Bid (t-Bid) Антиапоптотические белки семейства Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, Bcl-W, A1 и другие) ингибируют Bax в цитоплазме и в составе поры. Наконец, есть другие проапоптотические члены семейства Bcl-2, которые содержат только один домен гомологии с остальными представителями – домен BH3. Эти белки (к ним относятся, например, Bad, Bid, Bik, Puma, Noxa) ингибируют антиапоптотические белки или помогают открытию поры. Белки семейства Bcl-2 могут регулироваться на нескольких уровнях – транскрипции, протеасомной деградации, локализации на митохондриях, активации или дезактивации за счет фосфорилирования или процессинга (Green, Reed, 1998; Cory, Adams, 2002). Апоптоз, инициируемый в ядре при повреждении ДНК, повышенной пролиферативной активности, клеточном стрессе обычно задействует транскрипционный фактор р53 и каспазу 2 для последующей регуляции выхода цитохрома с из митохондрий (Чумаков, 2000; Norbury, Zhivotovsky, 2004).

Апоптоз, запускаемый с поверхностных рецепторов, может задействовать и митохондрии: каспаза 8 способна расщеплять Bid с образованием t-Bid и таким способом выходить на активацию каспазы 9. Необходимость этого пути для запуска апоптоза рецепторами семейства TNF зависит от типа клеток (Green, Reed, 1998; Nuñez et al., 1998).

Стимулами апоптоза могут служить нерепарируемые повреждения ДНК, избыточные или недостаточные концентрации гормонов и ростовых факторов, потеря адгезии на компонентах межклеточного матрикса (этот тип апоптоза, характерный для эпителиальных клеток, носит название «анойкис» – в переводе с греческого «бездомность»), несвоевременная или повышенная экспрессия белков-регуляторов клеточного цикла, вирусная инфекция, гипоксия или окислительный стресс, тепловой или осмотический шок, фармакологические агенты в определенных концентрациях. Регулируемыми звеньями машины инициации апоптоза является регуляция белков семейства Bcl-2, экспрессия прокаспаз, белков и лигандов семейства TNF, каспазных ингибиторов – белков IAP, а также ингибирующих инициацию апоптоза белков теплового шока (Dragovich et al., 1998; Jarpe et al., 1998; Strasser et al., 2000).

Многие трансформированные клетки кодируют белки, предотвращающие апоптоз. Так, меланомы и В-клеточные лимфомы имеют высокий уровень Bcl-2. Некоторые раковые клетки не экспрессируют Fas, но экспрессируют повышенные количества FasL, убивая цитотоксические Т-лимфоциты прежде, чем последние смогут убить их. Другие опухолевые клетки, особенно в случае рака легкого и толстой кишки, секретируют повышенные количества белков, связывающихся с FasL, который вырабатывается цитотоксическими Т-клетками, вследствие чего Fas клеточной мембраны раковой клетки не может связывать FasL (Ashkenazi, Dixit, 1998).

Рис. 9. Про- и антиапоптотические сигнальные пути, инициируемые рецепторами семейства TNF, содержащими домены смерти (по Ashkenazi, Dixit, 1998).	Рис. 7.
Рис. 10. Пути выхода цитохрома с из митохондрий (по Green, Reed, 1998). Показан путь через открытие МРТ (слева) и через поры, образуемые белками семейства Bcl-2 (справа).