2.1.5.2. Методы исследования клеточного цикла

Исследование распределения клеток по клеточному циклу обычно проводят на основе анализа содержания ДНК. Для этого ДНК клеток окрашивают флуорохромами, например, йодидом пропидия (PI), анализируют клетки методом проточной цитометрии и строят графики зависимости количества ДНК (интенсивности флуоресценции) от числа клеток. По различию распределения клеток по фазам клеточного цикла (G1+G0, S, G2+M) в экспериментальных и контрольных (когда клетки пролиферируют без остановок) условиях делают вывод о накоплении клеток в какой-либо фазе. Этот метод является почти обязательным при изучении клеточного цикла, но работает хорошо только в тех случаях, когда значительная часть изначально асинхронной популяции клеток останавливается в одной из фаз цикла, и при этом результаты не искажаются за счет уменьшения количества ДНК в апоптотических клетках.

Наряду с анализом распределения клеток по циклу для вывода о влиянии на прохождение клеточного цикла обязательно должны быть применены другие методы. Анализ скорости пролиферации клеток (кривые роста, построенные прямым подсчетом клеток, анализом тотального белка, или не нормированными на количество клеток методами МТТ/ХТТ) позволяет говорить об общей тенденции, хотя и не позволяет отличить остановку в клеточном цикле от равновесия в протекании пролиферации и апоптоза. Подсчет доли митотических клеток или анализ хромосом проточной цитометрией позволяет получить дополнительную информацию о доле клеток в G2 или в митозе. Анализ включения ³Н-тимидина или кратковременного включения бромдезоксиуридина (последнее – методом проточной цитометрии) позволяет отличить клетки, остановившиеся в фазе S, от клеток, реплицирующих ДНК, а также улучшить разрешение при оценке распределения по фазам. Долговременное включение бромдезоксиуридина может дать информацию о клетках, остановившихся в цикле (и не прошедших за время инкубации ни одной фазы S), а кратковременное включение бромдезоксиуридина с отмывками разной длительности позволяет далее получить информацию о длительности фаз клеточного цикла за счет селективного мечения S-фазных клеток.

Дополнением к исследованию собственно клеточного цикла являются иммунологические методы. Падение экспрессии пролиферативных маркеров (Ki-67, циклин D) позволяет отделить клетки, вышедшие из цикла в G0. Анализ активности циклин-зависимых киназ, экспрессии и фосфорилирования циклинов, циклин-зависимых киназ, их субстратов, ингибиторов и регуляторов открывает пути к установлению механизмов задержки или остановки в клеточном цикле.

2.1.5.3. Сигнальные пути регуляции клеточного цикла факторами роста

Решение об активации циклин-киназных комплексов фазы G1 и продвижении по клеточному циклу является результатом интеграции сигналов от факторов роста, цитокинов, других растворимых лигандов, компонентов внеклеточного матрикса, межклеточных взаимодействий и внутреннего состояния клетки, включая целостность ДНК. Для нормальных клеток факторы роста являются ключевым компонентом, определяющим прохождение фазы G1, но и для трансформированных клеток могут усиливать пролиферацию. Повышенная активность рецепторов факторов роста служит трансформирующим стимулом (Копнин, 2000; Ekholm, Reed, 2000; Schwartz, Baron, 1999). В то же время, известны случаи ингибирования пролиферации при действии на клетки EGF, PDGF и особенно факторов роста нервов. Обычно это связано либо с индукцией дифференцировки, либо с повышенным уровнем экспрессии соответствующего рецептора (Pumiglia, Decker, 1997; Schlessinger, 2000). Сигнальными путями от факторов роста, вызывающими продвижение по клеточному циклу, могут являться Ras, ERK, PI-3 киназа, реже стрессорные МАР-киназы, STAT3 и 5, PLCγ. Ингибирует пролиферацию продолжительная активация ERK или активация STAT1.

Активация Ras и следующая за ней активация ERK-каскада – наиболее известный путь активации пролиферации (рис. 7). ERK стимулирует пролиферацию через увеличение уровня циклина D1 за счет активации и накопления транскрипционных факторов Ets-семейства (Elk-1, Sap-1) и AP-1. Кроме этого, может иметь значение фосфорилирование факторов трансляции, уменьшение уровня циклин-киназного ингибитора р27^Kip1 за счет дестабилизирующего фосфорилирования, стабилизация и усиление экспрессии транскрипционного фактора с-Мус, непосредственное фосфорилирование сdk2 и усиление импорта комплексов циклин Е-сdk2 в ядро, аутокринная секреция ростовых факторов

Рис. 7. Малая регуляторная ГТФаза Ras в регуляции клеточного цикла (по Marshall, 1999).

EGF-семейства, фосфорилирование STAT-белков, фосфорилирование ферментов биосинтеза пиримидинов, необходимых для репликации ДНК, экспрессия (нанизком уровне) циклин-киназного ингибитора p21^Waf1, помогающего сборке комплексов циклин D-сdk4,6 в ранней фазе G1 (Marshall, 1999; Widmann et al., 1999; Keenan et al., 2001; Yang et al., 2003). С другой стороны, увеличение уровня р21^Waf1 при активации ERK может являться причиной наблюдаемого иногда антипролиферативного действия ERK, особенно при долговременной и сильной стимуляции ERK-каскада (Pumiglia, Decker, 1997).

Активация ERK-каскада – не единственный путь, по которому Ras влияет на пролиферацию. Пролиферативное влияние могут оказывать такие мишени Ras как PI-3 киназа, Ral, Rac, JNK-каскад (Downward, 1997; Marshall, 1999).

При стимуляции фибробластов, находящихся в G0, сывороткой, показано, что ростовые факторы нужны не постоянно, а только в течение двух коротких периодов – при первичной стимуляции и непосредственно перед точкой рестрикции. Кроме того, при постоянном росте фибробластов в присутствии сыворотки наблюдается две волны активации Ras, в начале G1 и перед точкой рестрикции. При первой волне Ras активирует ERK-каскад, а при второй волне активация ERK ослаблена. Считается, что смысл второй волны активации Ras заключается в передаче сигнала через PI-3 киназу (Downward, 1997; Marshall, 1999; Hulleman, Boonstra, 2000; Johnes, Kazlauskas, 2000).

PI-3-киназа стимулирует пролиферацию в основном через PKB/Akt. PKB удерживает в цитоплазме ингибитор циклин-зависимых киназ р27^Kip1 за счет непосредственного фосфорилирования, а также дестабилизирует его через фосфорилирование киназой mTOR (отдаленная мишень PKB) и за счет транскрипционной индукции SKP2, компонента убиквитин-лигазы для р27^Kip1. Ингибируя киназу GSK3, PKB передает сигнал к стабилизации циклина D1 и c-Myc. Через подавление активности транскрипционных факторов FoxO PKB снижает экспрессию р27^Kip1 и ингибирующего клеточный цикл циклина G2. Кроме того, PKB усиливает экспрессию генов циклина D и c-Myc и трансляцию их мРНК (Liang, Slingerland, 2003; Martinez-Gac et al., 2004).

МАР-киназа JNK способна как стимулировать, так и подавлять прохождение по клеточному циклу. Стимуляция пролиферации может идти через фосфорилирование с-Jun, c-Myc и Rb. В ряде случаев для обеспечения пролиферативного ответа необходима кооперация JNK с ERK. МАР-киназа р38 оказывает на клетки в основном антипролиферативное действие за счет активации и стабилизации транскрипционных факторов р53 и CHOP/GADD153, стабилизации p21^Waf1,а также дезактивации фосфатаз cdc25 (Kyriakis, Avruch, 2001; Kim et al., 2002).

О пролиферативном и антипролиферативном действии активируемых факторами роста транскрипционных факторов семейства STAT рассказывается в главе 3.