2.1.3.9. Негативная регуляция передачи сигнала от факторов роста

Эффективная передача сигнала подразумевает наличие работоспособной и регулируемой системы выключения сигнала (негативной регуляции). В случае рецепторов факторов роста она работает на нескольких уровнях. РКС, РКА и ERK могут ингибировать и дестабилизировать рецепторы факторов роста, PLCγ, МЕК, Sos. Роль негативного регулятора может играть киназа Ack, взаимодействующаяся с рецепторами через Grb2 или cdc42. Малые регуляторные ГТФазы выключаются при действии специфичных белков GAP. Тирозинфосфатазы, серин-треониновые фосфатазы и липидные фосфатазы осуществляют дефосфорилирование. Многие белки, накапливающиеся при передаче сигнала, направляются на деградацию в протеасомы. Наконец, активированный рецептор может эндоцитироваться и далее деградироваться в лизосомах. Основная регуляция эндоцитоза осуществляется на стадии сортировки в ранних эндосомах, когда происходит выбор между лизосомальной деградацией или рециклированием обратно на плазматическую мембрану. В регуляции эндоцитоза и/или сортировки могут быть задействованы убиквитинлигаза с-Cbl, тирозинкиназа Src, PI-3 киназа, белок Eps15 (Dikic, Giordano, 2003).

2.1.5. Механизмы регуляции пролиферации клеток при действии факторов роста

2.1.5.1. Клеточный цикл

Клеточный цикл соматических клеток делят на интерфазу и митоз. Основным событием интерфазы является репликация ДНК, а митоза – карио- и цитокинез. Внутри интерфазы выделяют фазы G1 (пресинтетическая фаза), S (фаза синтеза ДНК) и G2 (постсинтетическая фаза) (рис. 6 А). Строгая регуляция событий клеточного цикла служит для поддержания генетической стабильности дочерних клеток.

Для того чтобы клетка прошла клеточный цикл, необходимо последовательное преодоление так называемых контрольных, или сверочных точек (checkpoints). Обычно выделяют три основные контрольные точки: G1/S, G2/M и митотическую, или метафазную (между метафазой и анафазой митоза). Это те моменты в ходе прохождения клеточного цикла, когда клетка проверяет свое состояние (а в G1/S контрольной точке и статус внешних сигналов) и в случае, если что-то не в порядке, останавливается (блокируется) в клеточном цикле. Конечно, это несколько упрощенная схема: например, клетки могут останавли-

Рис. 6. Регуляция событий клеточного цикла (по Hulleman, Boonstra, 2000). А: Фазы клеточного цикла (G1, G0, S, G2, M) и комплексы циклинов и циклин-зависимых киназ, отвечающих за их прохождение. Стрелкой указан период клеточного цикла, когда присутствие факторов роста во внеклеточной среде необходимо для продвижения по клеточному циклу. R – точка рестрикции. Б: Изменение количества циклинов в различных фазах клеточного цикла. В: Ингибиторы циклин-зависимых киназ, их накопление и действие на циклин-киназные комплексы. Г: Регуляция транскрипции с участием транскрипционных факторов E2F за счет гиперфосфорилирования белка Rb при прохождении фазы G1 клеточного цикла.

ваться на разных этапах прохождения фазы G1, могут останавливаться в фазе S и т.д. В фазе G1 при прохождении G1/S контрольной точки клетка проверяет размеры, наличие питательных веществ, состояние ДНК, а также наличие разрешающих и отсутствие запрещающих пролиферацию сигналов извне. Именно в фазе G1 возможна физиологическая (не патологическая) остановка клеточного цикла в ответ на совокупность внеклеточных сигналов, например, при отсутствии факторов роста или адгезии на внеклеточном матриксе. Момент в ходе фазы G1, после которого присутствие факторов роста в среде теряет значение и клетка независимо от их присутствия проходит весь цикл до следующей фазы G1, называется точкой рестрикции. Многие авторы отдельно выделяют фазу G0. По сути, это особый вариант блока клеточного цикла в фазе G1 со своими биохимическими и морфологическими особенностями. Поскольку именно в фазе G0 оказываются клетки, которым «не надо» делиться, в том числе терминально дифференцированные клетки, и могут там оставаться неопределенно долго, может быть удобно рассматривать G0 не как блок в фазе G1, а как особую фазу «вне цикла» (Hulleman, Boonstra, 2000; Ekholm, Reed, 2000).

При прохождении G2/M контрольной точки проверяется в первую очередь полнота репликации. Поскольку механизм передачи сигнала от недореплицированной ДНК сходен с механизмом рецепции поврежденной ДНК, то именно в фазе G2 клетка чаще всего останавливается в ответ на повреждение ДНК (хотя остановка в других участках клеточного цикла тоже возможна). В метафазной контрольной точке проверяется, все ли хромосомы собраны на срединной пластинке и все ли кинетохоры соединены с натянутыми, готовыми к расхождению микротрубочками (Hulleman, Boonstra, 2000; Ekholm, Reed, 2000).

В нормальных клетках любая неполадка из вышеперечисленных может приводить к остановке клетки в клеточном цикле до тех пор, пока не поступит адекватный сигнал из внешней среды или до успешного осуществления репарации ДНК. В случае неудачи (или сразу же – в зависимости от типа клеток) в клетке запускается программа старения или апоптотической гибели. Парадоксально, но такие признаки, как способность останавливаться в отсутствие подходящих сигналов с клеточной поверхности и блоки клеточного цикла после повреждения ДНК, сцеплены. Это говорит о конвергенции сигналов с клеточной поверхности и с ДНК на общих мишенях. С другой стороны, блоки клеточного цикла на границе фаз G2/M в ответ на повреждение ДНК обнаруживаются у большинства клеток независимо от степени их трансформированности (хотя нормальные клетки обычно могут останавливаться быстрее и надежнее), а правильная регуляция перехода через границу фаз G1/S – это основное свойство нормальных клеток. Трансформируясь, клетки в той или иной степени приобретают способность к автономной, то есть независимой от внешних сигналов, пролиферации (Копнин, 2000; Hulleman, Boonstra, 2000).

Прохождение клеток по клеточному циклу регулируется активностью комплексов циклинов с циклин-зависимыми киназами (рис. 6 А) – главных двигателей клеточного цикла. Серин-треониновые циклин-зависимые киназы фосфорилируют белки-мишени только после связывания с циклинами, играющими роль регуляторной субъединицы. Активность циклин-киназных комплексов необходима для своевременного включения и выключения генов, регулирующих переход клеток от фазы к фазе. Соответственно, прохождение каждой фазы клеточного цикла контролируется своим набором циклин-киназных комплексов (рис. 6 А). В фазе G1 последовательно активируются комплексы циклин D1-3-Cdk4,6 и E-Cdk2. Активация комплекса циклин A-Cdk2 является сигналом к началу фазы S, и его активность остается высокой до окончания репликации. В фазе G2 работают комплексы циклин A-Cdс2 и циклин В-Cdc2. Для прохождения метафазной контрольной точки требуется деградация комплекса циклин В-Cdc2 (Hulleman, Boonstra, 2000; Ekholm, Reed, 2000). Хотя активность циклин-киназных комплексов в целом абсолютно необходима для пролиферации, отдельные циклины или циклин-зависимые киназы не всегда нужны: в последние годы выяснилось, что пролиферация клеток возможна не только в отсутствие циклина D, но и циклина Е, циклина А и даже в клетках-нокаутах по Cdk2 (Ciemerych, Sicinski, 2005)!

Активность циклин-киназного комплекса зависит от нескольких условий:

1) наличия (экспрессии) циклина;

2) активационного фосфорилирования циклин-зависимой киназы по треонину в киназном домене (осуществляется комплексом CAK);

3) отсутствия инактивационного фосфорилирования циклин-зависимой киназы по N-концу (фосфорилирование осуществляется киназой wee1, дефосфорилирование – фосфатазами cdc25);

4) отсутствия ингибиторов циклин-зависимых киназ;

5) импорта циклина или циклин-киназного комплекса в ядро (для циклина B это регулируется фосфорилированием циклина киназой Plk).

Каждый из этих механизмов подвержен регуляции со стороны сигнальных путей. Внешними сигналами в наибольшей степени регулируется количество циклинов и количество ингибиторов циклин-зависимых киназ.

Количество циклинов регулируется в первую очередь на уровне транскрипции и на уровне стабильности (протеасомной деградации). Циклины E, A и B синтезируются только в определенных фазах клеточного цикла, циклин D присутствует постоянно, если клетка не выходит в фазу G0 (рис. 6 Б). Транскрипция каждого следующего циклина опосредованно, через транскрипционные факторы, регулируется активностью предыдущего циклин-киназного комплекса, а также сигналами о внутреннем состоянии клетки. Так, фосфорилирование белка Rb комплексами циклин D-Cdk4,6 и циклин E-Cdk2 приводит к высвобождению транскрипционного фактора E2F, который стимулирует экспрессию циклинов E и A (рис. 6 В). Транскрипция и стабильность циклинов фазы G1, и в первую очередь основной изоформы циклина D – циклина D1, подвержена регуляции внешними сигналами, в том числе факторами роста (Hulleman, Boonstra, 2000; Ekholm, Reed, 2000).

Ингибиторы циклин-зависимых киназ относятся к одному из двух семейств – INK4 и Cip/Kip (рис. 6 Г). Ингибиторы семейства INK4 (p15, p16, p18, p19) ингибируют только киназы, способные ассоциироваться с циклином D, за счет замещения циклина в комплексе. Ингибиторы семейства Cip/Kip (p21^waf1, p27^Kip1, p57^Kip2) включаются в различные циклин-киназные комплексы третьим компонентом и обычно ингибируют активность комплекса. Для p21^waf1 ингибиторная роль проявляется обычно в случае сильного повышения его количества, а в малом количестве он, наоборот, может способствовать сборке циклин-киназных комплексов. p21^waf1 регулируется преимущественно на уровне транскрипции, а p27^Kip1 – на уровне стабильности, хотя известны и обратные случаи (Sherr, Roberts, 1999; Ekholm, Reed, 2000).