Раздел Биохимия. Лабораторная работа №6

«Выделение рибонуклеопротеидов и качественные реакции на их компоненты»

Цель работы: изучение состава РНП.

Задачи: 1) образовательная: провести гидролих РНП (рибонуклеопротеидов) дрожжей, определить компоненты РНП с помощьюкачественных реакций;

2) развивающая: развивать у студентов умение использовать полученные знания на практике, развивать логическое мышление, умение анализировать, обобщать и делать выводы;

3) воспитательная: формировать научное мировоззрение.

Теоретическая часть.

Hyклеиновые кислоты играют основную роль в сохранении и реализации генетической информации. Различают два типа нуклеиновых кислот: дезоксирибонуклеиновые кислоты [ДНК (DNA)], которые обеспечивают сохранение информации, и рибонуклеиновые кислоты [PHK (RNA)], принимающие участие в процессах генной экспрессии и биосинтеза белка. Нуклеиновые кислоты построены из нуклеотидных звеньев, которые в свою очередь состоят из азотистого основания, углеводного остатка и фосфатной группы. ДНК и РНК различаются по типу углеводного остатка и структуре оснований.

Рибонуклеиновые кислоты представляют собой полимеры из нуклеозидфосфатных звеньев, соединенных фосфодиэфирной связью. В качестве азотистых оснований в РНК присутствуют урацил, цитозин, аденин и тимин. Дезоксиибонуклеиновые кислоты также представляют собой полимеры из нуклеозидфосфатных звеньев, соединенных фосфодиэфирной связью. В качестве азотистых оснований в ДНК присутствуют тимин, цитозин, аденин и тимин. Предложенная в 1953 г. модель структуры ДНК позволила объяснить причину таких соотношений: интактная ДНК состоит из двух полидезоксинуклеотидных цепей. Каждое основание одной цепи связано с комплементарным ему основанием другой цепи водородными мостиками. При этом аденин комплементарен тимину (А – Т), гуанин — цитозину (Г – Ц).

В функциональном отношении две цепи ДНК не эквивалентны. Кодирующей цепью (матричной, смысловой) является та из них, которая считывается в процессе транскрипции. Именно эта цепь служит матрицей для PHK. Некодирующая цепь (антисмысловая) по последовательности подобна РНК (при условии замены T на U). Общепринято давать структуру гена в виде последовательности некодирующей цепи ДНК в направлении 5'→3'. Если прочитать кодоны в этом направлении, то с помощью генетического кода можно воспроизвести аминокислотную последовательность белка в принятом порядке, от N- к С-концу.

Большая часть нуклеиновых кислот в клетках встречается в виде комплексов с основными белками. такие комплексы называют нуклеопротеидами. Для изучения компонентов нуклеопротеидов используют пекарские дрожжи, содержащие рибонуклеопротеиды (РНП). В результате кислотного гидролиза РНП распадаются на составляющие компоненты: пуриновые и пиримидиновые основания, рибозу, фосфорную кислоту, пептиды.

Экспериментальная часть.

ОПЫТ 1. ПОЛУЧЕНИЕ ГИДРОЛИЗАТА ДРОЖЖЕЙ

В круглодонную колбу для гид­ролиза помещают 1 г пекарских дрожжей, доливают 20 мл 10 %-ного раствора серной кислоты и 20 мл дистиллированной воды, колбу закрывают пробкой, в которую вставлена в качестве холо­дильника стеклянная трубка длиной 20—30 см, кипятят под тягой в течение 1 ч на асбестовой сетке при слабом нагревании, после окончания гидролиза жидкость охлаждают, доводят водой до пер­воначального объема и фильтруют.

ОПЫТ 2. ОБНАРУЖЕНИЕ ПУРИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ В СОСТАВЕ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ

Метод основан на образовании комплексов пуриновых оснований с солями серебра.

К 1 мл гидролизата добавляют концентрированный раствор аммиака до получения щелочной среды (по лакмусу) н 0,5 мл раствора AgN0₃. Через 3—5 мин образуется рыхлый осадок серебряных солей пуриновых оснований.

ОПЫТ 3. ОБНАРУЖЕНИЕ ФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ В СОСТАВЕ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ

Метод основан на взаимодействии фосфорной кислоты с молибденовым реактивом с образованием окрашенного соединения.

К 1 мл гидролизата добавляют 1 мл молибденового реактива и кипятят. Жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет, а при охлаждении выпадает кристаллический осадок желтого цвета, обусловленный образованием фосфорномолибденовокислого аммония.

ОПЫТ 4. ОБНАРУЖЕНИЕ УГЛЕВОДНОГО КОМПОНЕНТА В СОСТАВЕ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ (РЕАКЦИЯ ТРОММЕРА)

А. К 0,5 мл гидролизата добавляют 1 мл 30% раствора гидроксида натрия и 3 капли 7% раствора сульфата меди. (11). Пробирку нагревают до кипения. Образование мелтого или красного осадка свидетельствует о наличии редуцирующих углеводов.

В. К 5 каплям гидролизата добавляют 20 капель 1% - ного раствора дифениламинового реактива (1 г дифениламина + 40 мл ледяной СН₃СООН+2,75 мл H₂SO_4конц, до 100 мл ледяной СН₃СООН) и кипятят на водяной бане 15 минут. Появляется сине-зеленое окрашивание. (Дифениламин с рибозой дает зеленое окрашивание, с дезоксирибозой – синее).

ОПЫТ 5. ОБНАРУЖЕНИЕ БЕЛКОВ В СОСТАВЕ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ

Биуретовая реакция характерна для соединений, содержащих не менее двух пептидных связей

В пробирку вносят 0,5 мл гидролизата, нейтрали­зуют (по лакмусу) раствором NaOH, затем добавляют 0,5 мл 10 % раство­ра NaOH и 2—3 капли 2 % раствора CuS0₄. Смесь перемешивают и на­блюдают появление красно-фиолетовой окраски, что свидетельствует о присутствии в пробе полипептидов, образующихся в результате гидролиза бел­ковой части нуклеопротеидов.

Химизм реакции можно представить следующими уравнениями:

NaOH+ CuSO₄ —> Na₂SO₄ + Cu(OH)₂↓

биурет медная комплексная

соль биурета

№	Название этапа работы	Условия реакции (реактивы, t°С, время, уравнение реакции)	Наблюдаемые эффекты
1.
2.

Контрольные задания:

1. Какие азотистые основания входят в состав РНК?

2. Содержание нуклеотидов в цепи и-РНК следующее: аденина — 27%, гуанина — 35%, цитозина — 18%, урацила — 20%. Определите процентный состав нуклеотидов участка молекулы ДНК (гена), являющегося матрицей для этой и-РНК.

3. Какую длину имеет участок ДНК, кодирующий синтез инсулина, который содержит 51 аминокислоту в двух цепях, если один нуклеотид занимает 3,4 А (ангстрема) цепи ДНК? 1 А = 0,1 нм (нанометра)?

4. В молекуле ДНК обнаружено 880 гуаниловых нуклеотидов, которые составляют 22% от общего количества нуклеотидов этой ДНК. Определите длину ДНК и содержание нуклеотидов каждого типа (в %)?

5. На фрагменте одной цепи ДНК нуклеотиды расположены в последовательности: А-А-Г-Т-Ц-Т-А-Ц-Г-Т-А-Т. Достройте схему двухцепочечной молекулы ДНК. Какова длина в нм этого фрагмента ДНК? (Каждый нуклеотид занимает 0,34 нм по длине цепи ДНК). Сколько нуклеотидов (в %) содержится в этой ДНК?

Основная литература:

1. Коровин, Н.В. Общая химия: учеб. / Н.В.Коровин. – М.: Высшая школа, 2000. – С.450-474

2. Коровин, Н.В. Лабораторные работы по химии /Н.В.Коровин, Э.М. Мингулина, Н.Г. Рыжова; Под ред. Н.В Коровина. – М.: Высшая школа, 2001. – С.180-185

Дополнительная литература:

1. Ахметов Н.С. Общая и неорганическая химия. М.: Высшая школа. 1988.

2. Васильева З.Г., Грановская А.А., Таперова А.А., Макарычева Е.П., Фриденберг Е. Э. Лабораторный практикум по общей химии. Полумикрометод. М., Химия, 1965.

3. Глинка Н.Л. Общая химия. Л. : Химия, 1983.

4. Лучинский Г. П. Курс химии. М.: Высшая школа,1985.

5. Фролов В.В. Химия. М. Высшая школа, 1986.

6. Зайцев О. С. Задачи и вопросы по химии. М.: Химия, 1985.

7. Романцева Л. М., Лещинская З. Л., Суханова В.А. Сборник задач и упражнений по общей химии. М.: Высшая школа,1980.