Работа 11. Распределение пластидных пигментов методом бумажной хроматографии

Материалы и оборудование: 1) свежие листья, 2) ацетон, 3) СаСО3, 4) петролей эфир или бензин, 5) кварцевый песок, 6) полоска хроматографической бумаги (1,5х2х20 см), 7) фарфоровая ступка, 8) колба Бунзена со стеклянным фильтром, 9) бюксы или баночки с притертыми пробками (2 щт), 10) цилиндр, закрытый пробкой с крючком, 11) насос Камовского.

Хроматографический метод разделения пигментов впервые предложенный проф. М.С.Цветом, имеет в настоящее время большое число вариантов. Широко используется для разделения пигментов и метод бумажной хроматографии. Он основан на различной адсорбции пигментов на бумаге

и разной растворимости в растворителях: чем лучше адсорбируется вещество, тем ближе к линии старта будет располагаться его зона.

Ход работы: Свежие листья растереть в ступке, добавляя кварцевый песок и СаСО3. Экстрагировать пигменты 100%-м ацетоном и профильтровать вытяжку в колбу Бунзена через стеклянный фильтр. Вытяжку (раствор пигментов) слить в емкость с притертой пробкой (на 2 – 3 гр материала около 25 мл ацетона). Эта операция проделывается одной бригадой, которая готовит вытяжку на всю подгруппу.

Полоску хроматографической бумаги опускают на несколько секунд в приготовленную вытяжку, при этом раствор пигментов поднимается на 1,5–2 см. Бумагу высушивают в токе воздуха (вентилятор) и снова опускают в вытяжку, повторяя операцию 5 – 7 раз, пока у верхней границы пигмента не образуется желто-зеленая полоса. Теперь нижний конец полоски погружают на несколько секунд в чистый ацетон, чтобы все пигменты поднялись на бумаге на 1 – 1,5 см. В результате на бумаге образуется стартовая полоса, в которой находится смесь пигментов. Полоску высушивают в токе воздуха до исчезновения запаха ацетона и помещают прикрепив к пробке, вертикально в цилиндр на дне которого находится слой петролейного эфира и бензина. Полоска должна так контактировать с жидкостью, чтобы растворитель не касался зоны пигментов.

Спустя 10 – 15 мин растворитель поднимается по бумаге на 10 – 12 см, при этом произойдет распределение пигментов. Отметить на полосе границы зон, зарисовать хроматограмму, обозначив на ней пигменты. Внизу будет расположен хлорофилл В, над ним – хлорофилл А, затем ксантофилл, а выше всех – каротин. Сделать вывод о причинах разделения пигментов на бумаге и указать степень адсорбции разных пигментов.

Работа 12. Оптические свойства пигментов.

Материалы и оборудование: 1) спиртовые или ацетоновые растворы хлорофилла разной концентрации, 2) раствор каротина (бензиновая вытяжка корнеплода моркови) и ксантофилла (получены разделением по Краусу), 3) спектроскопы, 4) настольные лампы, 5) цветные карандаши.

Одним из основных свойств пигментов листа является их способность поглощать световую энергию; однако это поглощение характеризуется избирательностью, т.е. разные участки спектра поглощаются неодинаково. Это доказывается разложением пропущенного через пигмент света при помощи призмы. В отдельных участках спектра будут видны темные полосы, что говорит о поглощении этих лучей. Полученный спектр назы-

вается спектром поглощения. Если сравнить спектры поглощения пигментов разной концентрации (можно брать раствор одной концентрации, но с разной толщиной слоя), можно определить степень поглощения отдельных лучей: чем концентрированнее раствор, тем сильнее он поглощает свет, и даже в слабопоглощаемых участках будут темные полосы. Лучи, которые поглощаются наилучшим образом, можно определить даже по спектру слабоконцентрированного раствора.

Хлорофилл обладает способностью к флюоресценции, т.е. свечению, возбуждаемому освещением. Свет, испускаемый при флюоресценции, имеет всегда большую длину волны, по сравнению с поглощенным, так как часть поглощенной энергии выделяется в виде тепла. У хлорофилла наблюдается красная флюоресценция.

Ход работы: Направить поток света в щель спектроскопа и отрегулировать четкость и яркость спектра. Поочередно помещать пробирки с раствором хлорофилла разной кон­центрации перед щелью спектроскана. Отметить положение черных полос, которые соответствуют поглощенным лучам. Сравнить -спектр поглощения хлорофилла и бензиновой вы-тяжки моркови. Заполнить таблицу, зарисовать цветными ка­рандашами спектры поглощения с нанесенными черными линиями.

Растворы

Ф

С

Г

З

Ж

О

К

1. Хлорофилл

очень слабый

слабый

средний

концентрированный

очень концентрир.,

2. Каротин

Пронаблюдать флюоресценцию хлорофилла, рассмотрев пробирку с вытяжкой сначала в проходящем свете, затем в отраженном. Сделать вывод об изменении окраски и причи­нах.