5.2.Дифференциальное центрифугирование

При дифференциальном центрифугировании (рис. 8) разделяемый материал, например

Рисунок 8. Дифференциальное центрифугирование.

гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения. На первой стадии параметры ускорения и времени выбирают так, чтобы максимально осадить крупные/тяжелые примеси. Затем супернатант отделяют и центрифугируют уже при больших значениях ускорения (а иногда и времени). При этом осаждается целевая фракция, которая, в общем случае, загрязнена более легкими примесями. Если необходим более чистый объект, то полученный осадок отделяют, суспендируют в новом растворе и повторно центрифугируют.

В случае необходимости получения нескольких фракций, например клеточных органелл, супернатант на второй стадии не отбрасывают, а вновь центрифугируют при других значениях ускорения.

Метод дифференциального центрифугирования является самым распространенным в лабораторной и промышленной практике и применяется не только для фракционирования, но и как аналог фильтрования – для отделения всего осадка из суспензий.

5.3.Зонально-скоростное центрифугирование

Метод зонально-скоростного (s-зонального) центрифугирования, основан на разделении объектов по зонам вследствие их разных скоростей седиментации (рис. 9).

Рисунок 9. Зонально-скоростное центрифугирование.

Прежде всего в пробирке формируют градиент плотности, причем плотность увеличивается по направлению к дну пробирки. Затем образец, суспендированный в растворителе с плотностью меньше, чем начальная точка градиента, наслаивают на поверхность жидкости в пробирке. Затем образец центрифугируют до тех пор, пока частицы не распределятся в виде дискретных зон или полос. Благодаря созданию градиента плотности удается избежать смешивания зон, возникающего в результате конвекции (градиент стабилизирует зоны, аналогично тому, что происходит в коктейле «Кровавая Мэри»).

При превышении времени центрифугирования зоны могут достигнуть дна пробирки и смешаться. Метод зонально-скоростного центрифугирования применяется для разделения гибридов РНК — ДНК, субъединиц рибосом и других клеточных компонентов.

5.4.Изопикническое центрифугирование

Метод изопикнического (равновесного) центрифугирования основан на разделении объектов по зонам вследствие их разных плотностей (рис. 10).

Рисунок 10. Изопикническое центрифугирование.

Плотности частиц должны быть в пределах градиента плотности. Градиент может создаваться заранее, как в методе зонально-скоростного центрифугирования или формироваться в процессе самого разделения вследствие баланса диффузионных и центробежных сил. В первом случае пробу наслаивают в виде зоны, во втором – она распределена по объему вместе с градиентообразующим веществом, в качестве которых используют соли тяжелых металлов, например хлориды рубидия или цезия, а также сахарозу. Образец, например, ДНК, смешивают с концентрированным раствором хлористого цезия. Метод применяется главным образом в аналитическом центрифугировании и был использован Мезельсоном и Сталем для изучения механизма репликации ДНК Е. coli.

5.5.Препаративные центрифуги

Современные препаративные центрифуги разделяются на низкоскоростные – до 8000 об./мин, скоростные – выше 8000 об./мин и ультрацентрифуги со скоростями порядка 100000 об./мин. Последние развивают ускорения порядка 800 000 g. Внутри этих классов приборы разделяются по сервисным возможностям, количеству сменных роторов и диапазонам нагрузок.

Низкоскоростные центрифуги в настольном и напольном исполнении комплектуются, как правило, сменными роторами: угловые и с подвесными стаканами или другими контейнерами для размещения центрифугируемых растворов. Объемы центрифугируемых растворов могут составлять как миллилитры для микроцентрифуг, так и литры для больших напольных машин. В большинстве центрифуг этого типа роторы жестко крепятся на валу привода, и центрифужные пробирки вместе с их содержимым должны быть тщательно уравновешены! Нельзя загружать в ротор нечетное число пробирок, а при неполной загрузке ротора пробирки следует размещать симметрично, одна против другой, обеспечивая таким образом равномерное распределение пробирок относительно оси вращения ротора.

Скоростные центрифуги развивают скорости порядка десятков тысяч оборотов в минуту и тоже могут быть самого разного размера. Камера ротора снабжена системой охлаждения для предотвращения нагревания, возникающего вследствие трения ротора о воздух. Охлаждение также требуется для длительных процессов центрифугирования лабильных веществ, например белков.

Ультрацентрифуги со скоростями до сотен тысяч оборотов в минуту снабжаются еще и системами вакуумирования.

Современная научная промышленность предлагает очень широкий ассортимент центрифуг, практически для любых применений..