8.4.Распределительная хроматография

Распределительная хроматография (РХ) основана на разнице в коэффициентах распределения разделяемых соединений (рис. 32). Коэффициенты распределения в свою очередь коррелируют с общей полярностью молекулы. Метод предназначен для разделения средне и сильнополярных веществ, в том числе и заряженных. Хорошо пригоден для разделения амфифильных соединений, таких как липиды.

В колоночной распределительной хроматографии низкого давления в качестве неподвижной фазы также применяют силикагель. При этом часто используют тройные системы, состоящие из неполярного компонента, воды и промежуточного растворителя, смешивающегося и с водой и с гидрофобным растворителем. Две наиболее часто используемых системы – это хлороформ-метанол-вода (ХМВ) и гексан-изопропанол-вода. При пропускании такого рода систем через силикагельную колонку на поверхности сорбента динамически создается слой неподвижной жидкой фазы, обогащенный водой (см. рис. 32), таким образом, мы имеем нормально-фазовую распределительную хроматографию.

Распределительная хроматография на силикагеле, аналогично адсорбционной, является плохо воспроизводимым методом и, как правило, используется для препаративных разделений на открытых колонках. При использовании вместо силикагеля модифицированных полярных фаз (см. выше) можно избежать этого эффекта.

Распределение аналитов происходит в растворе, поэтому распределительная хроматография отличается высокой нагрузочной способностью, примерно на порядок выше чем адсорбционная.

Рисунок 32. Механизм нормально-фазовой распределительной хроматографии.

Таблица 2. Особенности нормально-фазовой распределительной хроматографии.

Разделяемые вещества	Средне и высокополярные соединения, отличающиеся по суммарной полярности молекулы. Амфифилы – такие как липиды
Механизм разделения	Разница в коэффициентах распределения.
Сорбенты	Силикагель – открытые колонки Модифицированный полярными группами силикагель – ВЭЖХ.
Элюенты	Тройные смеси – вода, неполярный компонент и промежуточный растворитель. Хлороформ-метанол-вода (ХМВ), гексан-изопропанол-вода
Достоинства	Хорошо разделяет амфифильные соединения. Дешевые сорбенты для открытых колонок –силикагель. Высокая нагрузочная способность.
Недостатки	Плохая воспроизводимость. Малая чувствительность к взаимному расположению полярных и неполярных групп – практически не пригодна к разделению изомеров.

8.5.Эксклюзионная хроматография

Эксклюзионная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся внутри пор сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами, т.е. неподвижной фазой служит пористое тело или гель, а различное удерживание веществ обусловлено различия в размерах молекул веществ, их форме и способности проникать в поры неподвижной фазы. В названии метода отражен механизм процесса, от английского термина “Size Exclusion”, означающего исключение по размеру. Гель-проникающая хроматография (ГПХ) - эксклюзионная хроматография, в которой неподвижной фазой служит гель.

В отличие от остальных вариантов ВЭЖХ, где разделение идет за счет различного взаимодействия компонентов с поверхностью сорбента, роль твердого наполнителя в эксклюзионной хроматографии заключается только в формировании пор определенного размера, а неподвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры.

Принципиальной особенностью метода является возможность разделения молекул по их размеру в растворе в диапазоне практически любых молекулярных масс - от 10² до 10⁸, что делает его незаменимым для исследования синтетических высокомолекулярных веществ и биополимеров.

Рассмотрим принципиальные основы метода. Объем эксклюзионной колонки можно выразить суммой трех слагаемых:

V_с = V_м + V_i + V_d,

где V_м - мертвый объем (объем растворителя между частицами сорбента, иначе говоря, объем подвижной фазы); V_i - объем пор, занятый растворителем (объем неподвижной фазы); V_d - объем матрицы сорбента без учета пор. Полный объем растворителя в колонке V_t представляет собой сумму объемов подвижной и неподвижной фаз:

V_t = V_м + V_i.

Удерживание молекул в эксклюзионной колонке определяется вероятностью их диффузии в поры и зависит главным образом от соотношения размеров молекул и пор. Коэффициент распределения К_d, как и в других вариантах жидкостной хроматографии, представляет собой отношение концентраций вещества в неподвижной и подвижной фазах:

K_d = C₁/C₀

Так как подвижная и неподвижная фазы имеют одинаковый состав, то К_d вещества, для которого обе фазы одинаково доступны, равен единице. Эта ситуация реализуется для молекул с самыми малыми размерами (в том числе и молекул растворителя), которые проникают во все поры, и поэтому движутся через колонку наиболее медленно. Их удерживаемый объем равен полному объему растворителя V_t. Все молекулы, размер которых больше размера пор сорбента, не могут попасть в них (полная эксклюзия) и проходят по каналам между частицами. Они элюируются из колонки с одним и тем же удерживаемым объемом, равным объему подвижной фазы V_м. Коэффициент распределения для этих молекул равен нулю.

Принцип разделения и детектирования пробы в эксклюзионной хроматографии. А - ввод образца; В - разделение по размерам; С - выход крупных макромолекул; D - выход мелких макромолекул.

Связь между удерживаемым объемом и молекулярной массой (или размером молекул) образца описывается частной калибровочной кривой, т.е. каждый конкретный сорбент характеризуется своей калибровочной кривой, по которой оценивают область разделяемых на нем молекулярных масс. Точка А соответствует пределу эксклюзии, или мертвому объему колонки V_м. Все молекулы, масса которых больше, чем в точке А, будут элюироваться одним пиком с удерживаемым объемом V_м. Точка В отражает предел проникания, и все молекулы, масса которых меньше, чем в точке В, также будут выходить из колонки одним пиком с удерживаемым объемом V_t. Между точками А и В располагается диапазон селективного разделения. Соответствующий ему объем

V_i = V_t - V_м

принято называют рабочим объемом колонки. Отрезок CD представляет собой линейный участок частной калибровочной кривой, построенной в координатах V_R- lgM. Этот участок описывается уравнением

V_R = C₁ - C₂lgM,

где C₁ - отрезок, отсекаемый на оси ординат продолжением отрезка CD, С₂ - тангенс угла наклона этого отрезка к оси ординат. Beличину С₂ называют разделительной емкостью колонки, ее выражают числом миллилитров растворителя, приходящегося на один порядок изменения молекулярной массы. Чем больше разделительная емкость тем селективнее разделение в данном диапазоне масс. В нелинейных областях калибровочной кривой (участки АС и BD) в связи с уменьшением С₂ эффективность фракционирования заметно снижается. Кроме того, нелинейная связь между lgM и V_R существенно усложняет обработку данных и снижает точность результатов. Поэтому стремятся выбирать колонку (или набор колонок) так, чтобы разделение анализируемого полимера протекало в пределах линейного участка калибровочной кривой.

Если какое-либо вещество элюируется с удерживаемым объемом больше V_t, то это указывает на проявление других механизмов разделения (чаще всего адсорбционного). В общем случае в эксклюзионной хроматографии стремятся полностью подавить адсорбционные и другие побочные эффекты, так как они, особенно при исследовании молекулярно-массового распределения (ММР) полимеров, могут существенно исказить результаты анализа. Принципиальными отличиями эксклюзионной хроматографии от других вариантов являются априори известная продолжительность анализа в конкретной используемой системе, возможность предсказания порядка элюирования компонентов по размеру их молекул, примерно одинаковая ширина пиков во всем диапазоне селективного разделения и уверенность в выходе всех компонентов пробы за достаточно короткий промежуток времени, соответствующий объему V_t. Данный метод применяют преимущественно для исследования ММР полимеров и анализа макромолекул биологического происхождения (белки, нуклеиновые кислоты и т.д.).

Точность результатов в эксклюзионной хроматографии полимеров заметно зависит от температуры. При ее изменении на 10°С ошибка определения средних молекулярных масс превышает ±10%. Поэтому в данном варианте ВЭЖХ обязательно термостатирование разделительной системы. Как правило, достаточна точность поддержания температуры ±1°С в пределах до 80-100°С. В некоторых случаях, например, при анализе полиэтилена и полипропилена, рабочая температура составляет 135-150°С. Наиболее распространенным детектором в эксклюзионной хроматографии полимеров является дифференциальный рефрактометр.

Выбор сорбентов, обеспечивающих оптимальные условия для решения конкретной аналитической задачи, проводят в несколько этапов. Матрица геля должна быть химически инертной, т.е. в ходе эксклюзионной хроматографии не должно происходить химическое связывание разделяемых макромолекул. При разделении белков, ферментов, нуклеиновых кислот при контакте с матрицей не должна происходить их денатурация.

Свои характерные особенности имеет эксклюзионная хроматография в водных средах. Из-за специфики многих разделяемых систем (белки, ферменты, полисахариды, полиэлектролиты и др.) и разнообразия применяемых сорбентов существует очень много вариаций состава ПФ для подавления различных нежелательных эффектов. В качестве сорбентов применяют декстрановые гели (сефадексы), полиакриламидные, оксиакрилметакрилатнык гели, гели агарозы и др.

Таблица 3. Особенности эксклюзионной хроматографии.

Разделяемые вещества	В первую очередь биологические макромолекулы
Механизм разделения	Разница в размерах молекул
Сорбенты	Мягкие гели или твердые сорбенты (как правило диол-силикагель)
Элюенты	Буферные растворы
Достоинства	Разделяет по размерам. Высокая нагрузочная способность.
Недостатки	Низкая эффективность. Требуются длинные колонки.