8.2.Основы теории хроматографии

8.2.1.Общие понятия и принципы

Теория хроматографии далее будет рассматриваться на базе ВЭЖХ, однако все принципы полностью применимы и для других разновидностей хроматографических методов. Введем некоторые термины.

Сорбент - твердое вещество которое либо само проявляет связывающие свойства, либо удерживает на себе жидкость в варианте жидко-жидкостной хроматографии.

Элюент – жидкость или флюид используемые в качестве подвижной фазы.

Элюат - поток подвижной фазы выходящий из колонки, содержащий компоненты разделяемой смеси.

Хроматограмма - кривая, описывающая зависимость концентрации анализируемых веществ в элюате от времени.

Базовая (нулевая) линия - участок хроматограммы, соответствующий нулевому отклику детектора (нулевой концентрации) анализируемого компонента (компонентов).

Хроматографический пик - участок хроматограммы, соответствующий выходу анализируемого вещества из колонки.

В системе, содержащей элюент и сорбент разделяемое вещество может находится в трех состояниях.

1. Вещество обладает высоким сродством к сорбенту (НФ). В результате все молекулы связаны с сорбентом и вещество имеет нулевую скорость перемещения.

2. Вещество обладает высоким сродством к НФ. В результате все молекулы находятся в элюенте и вещество имеет скорость равную скорости подвижной фазы.

3. Молекула вещества, которое имеет сродство с сорбентом слегка ниже, чем сродство элюента с сорбентом (например в адсорбционной хроматографии) часть времени будет связана и неподвижна. В результате средняя скорость движения вещества будет находится в диапазоне от нуля до скорости движения элюента, в зависимости от силы связывания.

В результате, загрузив на колонку смесь веществ, подавая на нее элюент и отслеживая концентрацию веществ на выходе с помощью детектора мы можем получить хроматограмму.

Хроматографические пики в идеале представляют собой кривые нормального распределения (Гауссовы кривые), что связано со статистическими закономерностями размывания пробы в процессе хроматографии.

8.2.2.Параметры хроматографического разделения

Типичная хроматограмма представлена на рисунке 25.

Рисунок 25. Типичная хроматограмма смеси неудерживаемого вещества и двух удерживаемых.

Каждый пик на хроматограмме имеет свое время удерживания – время от ввода пробы до выхода максимума пика. Этот параметр, однако, зависит от скорости потока элюента и геометрических параметров колонки, поэтому его нельзя использовать для качественной характеристики вещества. Время при котором выходит пик неудерживающегося вещества называется мертвым временем колонки и соответствует времени нахождения элюента в колонке.

Параметр K – фактор удерживания или коэффициент емкости, который рассчитывается по формуле приведенной на рисунке 25, является инвариантной величиной и характеризует только взаимодействие аналита с элюентом и сорбентом. Именно этот параметр корректно приводить в описании хроматографических процессов.

Для количественной оценки разделения двух пиков служит параметр α - селективность, рассчитываемый как отношение двух факторов удерживания (см. рис. 25) или двух исправленных времен удерживания. Селективность не может быть меньше 1, что соответствует полностью неразрешенным пикам, т.е. веществам с одинаковыми временами удерживания.

Для оценки качества хроматографических колонок в качестве меры эффективности вводится понятие N - число теоретических тарелок. В рамках практической работы хроматографистов этот параметр расчитывается из параметров хроматограммы (рис. 26).

Рисунок 26. Расчет числа теоретических тарелок по данным хроматограммы.

Каждая колонка для ВЭЖХ в обязательном порядке поставляется с паспортом, который включает тестовую хроматограмму с рассчитанными для каждого пика числами теоретических тарелок. Чем мельче сорбент в колонке, тем выше эффективность и, безусловно, стоимость. Стандартные современные колонки с 5 мкм сорбентом имеют порядка 4000 теоретических тарелок. Реже встречается величина «высота эквивалентная теоретической тарелке» (ВЭТТ) которая расчитывается путем деления длины колонки на число теоретических тарелок (см. рис. 26). В фармакопейных методиках нормируется минимальное число теоретических тарелок для пика аналита.

Параметр селективности говорит о том, как отличаются удерживания двух веществ в хроматографическом процессе, но не учитывает влияния эффективности. Для того, чтобы количественно описать степень разделения пиков вводится критерий разрешения Rs (или просто – разрешение см. рис. 27).

Рисунок 26. Критерий разрешения.

Разрешение равно нулю, для полностью неразделенных пиков, после чего, по мере расхождения аналитов увеличивается. Считается, что для надежного количественного анализа необходимо разделение пиков до базовой линии, что соответствует Rs=1.

Разрешение зависит от коэффициентов емкости, селективности и эффективности по уравнению, приведенному на рисунке 27.

Рисунок 27. Уравнение для расчета критерия разрешения из селективности α, среднего коэффициента емкости для двух пиков и числа теоретических тарелок N.

Анализ данного уравнения дает нам несколько важных практически применимых выводов. Прежде всего становится понятным, что наибольший вклад в разрешение дает селективность. Соответственно, если мы обнаруживаем на хроматограмме плохо разрешенные соединения, то первым делом мы должны изменять состав элюента или подбирать новый сорбент.

Второй по значимости вклад дает коэффициент емкости, однако не имеет смысла увеличивать его больше 10, поскольку дальше его влияние практически не сказывается.

Третий член уравнения показывает, что разрешение пропор­ционально корню квадратному из числа теоретических тарелок. Для увеличения эффективности в два раза необходимо в четыре раза увеличить длину колонки, наполненной аналогичным сорбентом. Естественно, что при этом увеличится и время анализа и давление на колонке.

Влияние эффективности на разрешение самое слабое, однако современная хроматография продолжает развиваться в направлении повышения эффективности колонок, в основном используя все более мелкие сорбенты, вплоть до 2 мкм. Связано это с тем, что подобрать элюенты, разделяющие все компоненты сложных смесей с достаточными значениями селективностей весьма трудно, а зачастую и невозможно. В этих случаях высокая эффективность является единственной работающей альтернативой.

Эще раз подчеркну, что повышение селективности – это первый шаг в оптимизации любого разделения. Представим себе гипотетическую ситуацию, когда нам необходимо добиться разделения всего двух пиков (рис.28). При этом мы взяли простую, дешевую колонку и в первом же эксперименте получили неразделенные пики (А).

Рисунок 28. Влияние селективности и эффективности на разделение двух пиков.

Как было отмечено ранее, оптимальным является путь повышения селективности (A ->B), однако если в вас на полке лежит аналогичная, но более эффективная колонка, то можно реализовать и вариант (A->C). Следует отметить, что по упомянутому ранее критерию нормального разделения анализа (Rs=1) ситуации B и С на рисунке 28 эквивалентны, при этом вариант С высокой эффективностью требует заведомо более дорогой колонки, а вариант B скорее всего потребует большего времени анализа и, возможно, применения более дорогих растворителей. Выбор оптимальных условий анализа в таком случае зависит, кроме всего прочего, от экономических соображений. Из тех же соображений вариант D не является оптимальным для аналитика в связи с избыточностью разделения.