Оглавление

1. Определение БАС 3

2. Цели выделения БАС 3

3. Первичная обработка биологического сырья. 3

3.1. Сырье для выделения БАС 3

3.2. Обобщенная схема выделения БАС 4

3.3. Сепарация. 5

3.4. Консервация. 5

3.4.1. Охлаждение. 5

3.4.2. Консерванты 5

3.4.3. Уменьшение содержания воды 6

3.4.4. Герметизация 6

3.5. Измельчение и гомогенизация 6

3.5.1. Физические методы 7

3.5.2. Физико-химические методы 8

3.5.3. Химические методы 8

4. Экстракция 8

4.1. Классическая экстракция. 8

4.2. Сверхкритическая экстракция (SFE) 9

4.3. Твердофазная экстракция 9

5. Центрифугирование 11

5.1. Общие принципы центрифугирования 11

5.2. Дифференциальное центрифугирование 12

5.3. Зонально-скоростное центрифугирование 13

5.4. Изопикническое центрифугирование 14

5.5. Препаративные центрифуги 14

5.6. Конструкция роторов 15

5.7. Аналитические ультрацентрифуги 16

5.8. Определение молекулярных весов 18

5.8.1. Метод скорости седиментации 18

5.8.2. Метод седиментационного равновесия 19

5.8.3. Метод приближения к седиментационному равновесию 19

5.9. Исследование конформационных изменений в макромолекулах 20

5.10. Методы создания градиентов для центрифугирования 20

5.11. Извлечение продуктов из центрифужных пробирок 21

6. Мембранные технологии 22

6.1. Диализ 22

6.2. Электродиализ 23

6.3. Ультрафильтрация 24

6.4. Материалы мембран 24

6.5. Другие виды фильтрации 25

7. Буферные растворы. 26

8. Хроматография 28

8.1. Классификация хроматографических методов 28

8.1.1. Классификация по агрегатному состоянию фаз 28

8.1.2. Классификация по технике исполнения 28

8.1.3. Классификация по принципам разделения 29

8.2. Основы теории хроматографии 30

8.2.1. Общие понятия и принципы 30

8.2.2. Параметры хроматографического разделения 31

8.3. Адсорбционная хроматография 35

8.4. Распределительная хроматография 39

8.5. Эксклюзионная хроматография 40

8.6. Ионообменная хроматография 44

8.7. Аффинная хроматография 47

8.8. Обращенно-фазовая хроматография 49

8.9. Ион-парная хроматография 53

1.Определение бас

Термином БАС (биологически активные соединения) мы будем называть любые вещества, оказывающие воздействия на живые организмы или являющиеся продуктами их жизнедеятельности (в том числе и метаболитами). Основными классами таких веществ являются аминокислоты, белки, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы, низкомолекулярные метаболиты (например биогенные амины), гликозиды, алкалоиды и т.д. Кроме того, мы причисляем к БАС и разнообразные лекарственные средства.

2.Цели выделения бас

1. Выделение неизвестного вещества (веществ) в количестве, необходимом для определения его структуры. Такого рода работы могут иметь чисто научное значение (изучение всех алкалоидов в данном растении) или более прикладное – например определить, какое именно вещество ответственно за лечебный эффект, проявляемый слизью тропической лягушки листолаза ужасного.

2. Выделение необходимого количества конкретного (известного) вещества для дальнейшего изучения (например для исследования биологической активности.

3. Получение значительного количества конкретного (известного) вещества для дальнейшего использования (например в качестве лекарственного средства).

Выделенные вещества должны иметь чистоту, достаточную для решения этих задач.

3.Первичная обработка биологического сырья.

3.1.Сырье для выделения бас

1. Синтетическое сырье – продукты химических реакций

2. Природное сырье

   1. Животные ткани и органы

   2. Растительные ткани и органы

   3. Микроорганизмы

      1. Бактерии

      2. Грибы

      3. Простейшие

Для выделения БАС из синтетического сырья используются, как правило, методы экстракции, фильтрации и упаривания. Биологическое сырье требует более сложных подходов.

Тип исходного биологического материала оказывает большое влияние на методы, применяемые для его обработки. Так, растительное сырье гораздо менее требовательно к методам консервации по сравнению с органами животных. Наличие прочных клеточных стенок у растений и некоторых микроорганизмов затрудняет гомогенизацию, что требует в некоторых случаях применения таких жестких методов, как пресс Хьюза. Напротив, суспензии культур тканей разрушаются гораздо более мягкими методами.

3.2.Обобщенная схема выделения бас

Обобщенная схема выделения БАС представлена на рис. 1. В зависимости от конкретной задачи практически любые стадии могут быть пропущены, дополнены или изменены. В случаях, когда природа целевого БАС затрудняет его выделение в нативном виде, схема может дополняться стадией химической модификации.

Рисунок 1. Обобщенная схема выделения БАС.

Первичная сепарация подразумевает выделение той части объекта, которая содержит интересующее нас вещество. Например, физическое отделение цветков у растений, органов у животных или разделение биомассы и культуральной жидкости у микроорганизмов (с помощью фильтрования или центрифугирования).

Консервация необходима для того, чтобы нужное нам БАС сохранилось в сырье до начала обработки.

Гомогенизация (измельчение) применяется либо для облегчения экстракции, либо для доступа к клеточным органеллам содержащим нужный нам объект.

Сепарация – в случае необходимости выделения конкретных клеточных органелл из гомогенизата как правило используется центрифугирование.

Экстракция – перевод вещества в нужный для дальнейшей обработки раствор из твердой смеси или раствора в неподходящем растворителе (например извлечение гидрофобных соединений из водных растворов может проводиться хлороформом).