УСТРОЙСТВА ДЛЯ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Хроматограф жидкостный

Самыми распространенными хроматографическими системами являются системы, имеющие модульный принцип сборки. Насосы, дегазирующие устройства, детекторы, дозаторы (автосамплеры), термостаты для колонок, коллекторы фракций, блоки управления хроматографической системой и регистрирующие устройства выпускаются в виде отдельных модулей. Широкий выбор модулей позволяет гибко решать различные аналитические задачи, быстро менять при необходимости конфигурацию системы с минимальными расходами. Вместе с тем выпускаются и мономодульные (интегрированные) ЖХ, главным преимуществом которых является миниатюризация отдельных блоков, компактность прибора.

В зависимости от способа элюирования жидкостные хроматографы делятся на изократические и градиентные.

Схема изократического хроматографа

Подвижная фаза из емкости (1) через входной фильтр (9) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Далее, через in-line фильтр (8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило насоса или системного контролера), с клавиатур каждого из модулей системы или производиться управляющей программой с персонального компьютера.

В случае градиентного элюирования используются два принципиально различных типа жидкостных хроматографов. Они отличаются точкой формирования градиента состава подвижной фазы.

Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии низкого давления.

Подвижная фаза из емкостей (1) через входные фильтры (9) и программатор градиента (10) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой клапанов программатора градиента управляет либо управляющий модуль системы (насос или контроллер), либо управляющая программа ПК. Системы такого типа формируют бинарный, трехмерный и четырехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр (8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.

Несмотря на кажущуюся привлекательность таких систем (в них используется всего лишь один прецизионный насос высокого давления), данные системы обладают рядом недостатков, среди которых основным, пожалуй, является жесткая необходимость тщательной дегазации компонентов подвижной фазы еще до смесителя низкого давления (камеры программатора градиента). Она осуществляется с помощью специальных проточных дегазаторов. Из-за этого факта стоимость их становится сравнимой с другим типом градиентных систем - систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления.

Принципиальным отличием систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления является смешение компонентов в линии высокого давления, естественно, что при данном подходе количество прецизионных насосов определяется количеством резервуаров для смешивания подвижной фазы. При таком подходе требования к тщательности дегазации компонентов существенно снижаются.

Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии высокого давления.

Подвижная фаза из емкостей (1) через входные фильтры (9) подается прецизионными насосами высокого давления (2 и 11) через статический или динамический смеситель потока (10) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой управляемых насосов управляет либо управляющий модуль системы (насос “master pump” или контроллер), либо управляющая программа ПК. В этом случае все насосы являются управляемыми. Системы такого типа формируют бинарный или трехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр(8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.

Предложенные схемы являются достаточно упрощенными. В состав систем могут быть включены дополнительные устройства - термостат колонок, системы постколоночной дериватизации, системы пробоподготовки и концентрирования образца, рециклер растворителя, мембранные системы подавления фоновой электропроводности (для ионной хроматографии), дополнительные защитные системы (фильтры, колонки) и т.д. На схемах, также отдельно не показаны манометрические модули. Как правило, эти устройства встраиваются в насосные блоки. Эти блоки могут объединять в себе несколько насосов, насос с программатором градиента, а также общий системный контроллер. Структура системы зависит от ее комплектации и каждого конкретного производителя.

Такое радикальное усложнение технического сопровождения хроматографического процесса приводит к возникновению ряда требований к свойствам подвижной фазы, отсутствующих в классической колоночной и планарной хроматографии. Жидкая фаза должна быть пригодна для детектирования (быть прозрачной в заданной области спектра или иметь низкий показатель преломления, определенную электропроводность или диэлектрическую проницаемость и т.д.), инертна к материалам деталей хроматографического тракта, не образовывать газовых пузырей в клапанах насоса и ячейке детектора, не иметь механических примесей.

Хроматографическая колонка

Хроматографическая колонка - центральная, принципиально главная часть хроматографической системы. Обычно колонка имеет геометрию удлиненного цилиндра с жесткими стенками, изготовленного из металлических, стеклянных или полимерных трубок. Колонка может быть наполнена сорбентом, или представлять собой полую трубку с нанесенным на внутреннюю поверхность сорбентом, в объеме которого осуществляется хроматографическое разделение смеси веществ. Успешная реализация хроматографического процесса зависит не только от параметров сорбента и подвижной фазы, но и от технических характеристик колонки в целом. Колонка должна быть равномерно заполнена максимально однородным слоем сорбента, должны быть сведены к минимуму мертвые объемы в колонке и во всем хроматографическом тракте между инжектором, колонкой и детектором.

Молекулы сорбата движутся по колонке, когда они находятся в подвижной фазе, и остаются на месте, когда находятся в неподвижной фазе. Чем больше сродство сорбата к неподвижной фазе и чем меньше к подвижной - тем медленнее он движется по колонке и тем дольше в ней удерживается. За счет различия в сродстве компонентов смеси к подвижной и неподвижной фазам достигается основная цель хроматографии - разделение компонентов на отдельные концентрационные зоны (пики), по мере их продвижения по колонке с подвижной фазой. Хроматографическое разделение возможно только в том случае, если компоненты образца, попадая в колонку при вводе пробы, во-первых, могут быть растворены в подвижной фазе и, во-вторых, будут обратимо взаимодействовать с

н еподвижной фазой. Если при вводе пробы какие-то компоненты находятся не в виде раствора, они будут отфильтрованы и не будут участвовать в хроматографическом процессе. Точно так же компоненты, не взаимодействующие с неподвижной фазой, пройдут через колонку, не разделяясь на индивидуальные пики.

В зависимости от площади поперечного сечения и длины колонки можно разделить на макромасштабные препаративные, препаративные, полупрепаративные, стандартные аналитические колонки, микроколонки и капиллярные колонки.

Тип колонки	Длина, мм	Внутренний диаметр, мм	Размер частиц, мкм	Объём вводимой пробы, мкл	Расход элюента, мл/мин
крупномасштабные препаративные	>1500	>50	30-200	1·104 -2·106	100-200
стандартные препаративные	300-1500	40-75	6-105	1·104 -1·106	20-140
полупрепаративные	100-700	20-50	6-105	100-1·104	1-20
стандартные аналитические	50-250	1-6	4-20	5-10	0.5-5
аналитические микроколонки	50-250	0.5-2	3-10	1-5	0.01-0.25
капиллярные колонки	50-55000	0.18-0.5	3-5	0.01-1	0.005-0.05

Трубка стандартной аналитической колонки с обеих сторон закрывается фильтрами (фритами), предотвращающими высыпание сорбента из колонки, а также препятствующими разрушению слоя сорбента механическими примесями, писутствующими в пробе или подвижной фазе. С детектором и дозатором колонка соединена стандартными капиллярами с наружным диаметром 1.6 мм. Внутренний диаметр капилляров составляет 0.2-0.3 мм. Фильтры имеют диаметр пор около 2 мкм. Фильтры и капилляры крепятся на колонке штуцерами разной конструкции, в состав фитингов входят также уплотняющие кольца и конусы.

Выпускаются также колонки с конструкцией патрона. В этом случае колонка выполнена из полимера и заключена в кожух, в котором создается высокое давление, обеспечивающее плотный контакт частиц сорбента со стенкой колонки за счет частичной деформации последней. Функции фильтров в колонке не ограничиваются удерживанием сорбента, они распределяют поток и пробу, попадающие в начало колонки.

Необходимость перехода от малого диаметра в капилляре к большому в трубке самой колонки, высокий перепад давлений на колонке в процессе упаковки и при работе, недопустимость образования мертвых объемов обуславливают конструкционные особенности колонок. Для получения высокой эффективности колонки большое значение имеет высокое качество обработки внутренней поверхности трубки колонки.

Классические типы соединения колонок с хроматографическим трактом:

а - соединитель с малым мертвым объемом, компрессионной гайкой и фильтром обычного типа; б - соединитель с нулевым мертвым объемом, наружной гайкой и фильтром, запрессованным в политрифтор-хлорэтилен; в - соединитель с малым мертвым объемом и распределительным конусом.

Вид хроматограммы в зависимости от эффективности и селективности хроматографической системы

: а - нормальная селективность, пониженная эффективность; б - нормальная эффективность и селективность; в - повышенная селективность, нормальная эффективность.

Качество хроматографической колонки характеризуют прежде всего ее эффективностью. Она тем выше, чем уже ширина пика при том же времени удерживания. Эффективность колонки измеряется числом теоретических тарелок N. Чем выше эффективность, тем больше величина N. Другими количественными критериями качества колонки являются Н - высота, эквивалентная теоретической тарелке, Н' - приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке, и приведенное число теоретических тарелок N’. Определения и формулы для расчетов параметров эффективности колонки приведены здесь.

Для типовых качественных колонок для ВЭЖХ N' находится в диапазоне значений 50 - 100 тыс. теоретических тарелок на 1 м.

Значения N, N’, Н и Н' позволяют сравнивать эффективность колонок разных типов, разной длины, заполненных разными по природе и зернению сорбентами. Сравнивая N двух колонок одной длины, сопоставляют их эффективность. При сравнении H оценивают качество колонок с сорбентами одинакового зернения, но имеющими разную длину. Наконец, величина Н' позволяет для двух любых колонок оценить качество сорбента, во-первых, и качество заполнения колонок, во-вторых, независимо от длины колонок, размера частиц сорбента и его природы.

Селективность колонки α, а вернее хроматографической системы в целом, играет большую роль в обеспечении надежного хроматографического разделения. Селективность колонки зависит от многих факторов, варьируя которые можно подобрать оптимальные условия хроматографии заданной смеси компонентов.

В ходе хроматографирования в колонке и вне ее по мере прохождения по хроматографическому тракту (дозатор, предколонка, колонка, детектор, коллектор фракций, соединенные друг с другом капиллярами) происходит размывание узкой концентрационной зоны введенного вещества. По мере ее движения с подвижной фазой по тракту зона становится все шире, размываясь в результате диффузионных процессов. Эффект размывания характеризуется шириной пика у основания t_W, которую определяют как отрезок, отсекаемый на нулевой линии двумя касательными, проведенными к пику. Ширина пика увеличивается пропорционально квадратному корню из длины пути, пройденного веществом в колонке.

Мерой размывания полосы вещества в колонке является эффективность, определяемая числом теоретических тарелок N или высотой, эквивалентной теоретической тарелке, H.

Размывание хроматографических зон обусловлено в основном тремя следующими причинами.

1) Неоднородностью потока по сечению колонки, вследствие которой молекулы разделяемого вещества проходят пути различной длины. Влияние этого эффекта минимально, если колонка равномерно заполнена частицами малого диаметра с узким распределением частиц по размерам.

2) Продольной диффузией. Влияние этого вида диффузии в жидкостной хроматографии относительно мало, поскольку коэффициенты диффузии растворителей невелики, и этот эффект становится ощутимым лишь в том случае, если вещество находится в колонке длительное время.

3) Диффузией и сопротивлением массопереносу молекул, перемещающихся из одной фазы в другую, и отклонением от состояния равновесия вследствие диффузии. Величина данного эффекта в значительной степени зависит от объемной скорости. Снижение объемной скорости и использование сорбентов с малым размером частиц и открытой пористой структурой (это снижает длину диффузионного пути) уменьшают влияние эффекта. Повышение температуры колонки также уменьшает сопротивление массопередаче, так как увеличивает коэффициенты диффузии и уменьшает вязкость.

Общая величина H колонки выражается суммой вкладов всех этих факторов:

Н = Н_p + Н_d + Н_s + Н_m ,

где Н_p - вклад в размывание вихревой диффузии; Н_d - вклад в размывание молекулярной диффузии; Н_s - вклад, связанный с сопротивлением массопередаче в неподвижной фазе; Н_m - вклад, связанный с сопротивлением массопереносу в подвижной фазе. Чем меньше каждое из четырех слагаемых, тем меньше будет и суммарное значение H, а следовательно, эффективнее колонка.

Величина Н_p пропорциональна диаметру частиц сорбента и уменьшается с улучшением равномерности заполнения колонки сорбентом. Величина Н_d, заметно растет при низком расходе ПФ, что имеет значение в микроколоночной ВЭЖХ на насосах среднего давления. При типовых скоростях элюирования Н_d настолько мала, что ею можно пренебречь. Величина Н_m уменьшается при ускорении процессов адсорбции-десорбции, т. е. при использовании частиц малого размера и тонких пленок НФ, при уменьшении скорости потока. Кроме того, величина Н_m уменьшается при снижении размера частиц (пропорционально квадрату диаметра частиц), при более равномерном и плотном заполнении колонки сорбентом, уменьшении вязкости ПФ.

Таким образом, к числу основных параметров, контролирующих высоту, эквивалентную теоретической тарелке, относятся: объемная скорость, диаметр частиц сорбента (длина диффузионного пути), характер заполнения колонки, геометрия заполнения и коэффициент диффузии. Иначе говоря, размывание в колонке уменьшается и эффективность повышается, когда используют более мелкий сорбент, более равномерный по составу (узкая фракция), более плотно и равномерно упакованный в колонке, при использовании более тонких слоев привитой фазы, менее вязких растворителей и оптимальных скоростей потока.

Что касается размывания концентрационной зоны в таких частях хроматографического тракта, как инжектор, ячейка детектора, микрофильтры для улавливания механических частиц из пробы, устанавливаемые после инжектора, предколонки, капилляры, фитинги и др., оно тем больше, чем больше экстраколоночный объем по сравнению с удерживаемым объемом пика. В современных хроматографах источники дополнительного экстраколоночного размывания тщательно минимизируют.

Как сказано выше, эффективность колонки зависит от размера частиц сорбента. В большой степени бурное развитие ВЭЖХ в последние годы было обусловлено, во-первых, разработкой способов получения сорбентов с размером частиц от 1.5 до 10 мкм с узким фракционным составом, обеспечивающих высокую эффективность при хорошей проницаемости, во-вторых, разработкой способов заполнения этими сорбентами колонок и, в-третьих, разработкой и серийным выпуском жидкостных хроматографов, имеющих рассчитанные на высокие давления насосы, инжекторы и детекторы с кюветами малого объема, способные регистрировать пики малого объема.

Для хорошо упакованных суспензионным способом колонок приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке W ≈ 2 при размере частиц 3-10 мкм. В этом случае при стандартной длине колонок 250 мм их эффективность будет составлять от 40 до 12.5 тысяч теоретических тарелок. Наиболее эффективные колонки, заполненные частицами размером 1.5 мкм, требуют очень высокого рабочего давления насоса (до 320 МПа) и относительно низкой скорости потока элюента. При поиске компромиссного решения возникает вопрос о взаимосвязи размера частиц сорбента, эффективности и проницаемости колонок. Уравнение, которое связывает давление, размер частиц и другие важные хроматографические параметры, имеет следующий вид:

u = B_o p / ηL = рd²/ ψηL ,

где u - линейная скорость потока, определяемая из уравнения t_o = L/u; В_o - проницаемость колонки; р - давление; η - вязкость; L - длина колонки; ψ-фактор сопротивления колонки, d - диаметр частиц сорбента.

Согласно этой формуле, давление на входе в колонку пропорционально линейной скорости потока, фактору сопротивления колонки, вязкости растворителя и длине колонки, и обратно пропорционально квадрату диаметра частиц. Расчеты показывают, что существуют ограничения возможностей применения мелкодисперсных сорбентов (зернением < 5 мкм) в обращенно-фазовой ВЭЖХ, в связи с резким возрастанием противодавления. Для работы с такими сорбентами в режиме ОФХ требуются специальные насосы. Это требование менее критично для НФХ. Проницаемость колонки при прочих равных условиях лимитирует использование больших расходов растворителей, позволяющих сократить время анализа. Современной скоростной ВЭЖХ необходимы насосы, работающие со сверхвысокими давлениями.

При оценке качества колонки зачастую учитывается коэффициент асимметрии A_S. Предпочтение отдается колонкам, для которых значения A_S, лежат в интервале 0.8 - 1.2. Отклонение A_S от 1.0 обусловлено многими факторами, в том числе неравномерным распределением пробы по сечению колонки, наличием мертвых объемов, плохим качеством обработки стенки колонки и др.

Ряд фирм в качестве параметра качества колонки использует стабильность колонки, т. е. воспроизводимость N и A_S при проведении повторных анализов, которые, однако, существенно зависят от условий проведения эксперимента. Помимо ухудшения эффективности, проницаемости и симметрии пиков имеется еще и визуально контролируемый признак нестабильности - усадка слоя сорбента ниже верхнего обреза колонки. Основная причина проседания сорбента в колонке и потери эффективности - растворение самого силикагеля, даже привитого. Соответственно, предлагаются и разные способы предотвращения нестабильности и проседания, например особый метод заполнения ("вязкостная консолидация"), который позволяет получать высокоэффективные колонки, не проседающие длительное время и сохраняющие при этом нормальную проницаемость.

Для потребителей наиболее очевидными характеристиками приобретаемой или приготовляемой хроматографической колонки являются значения приведенного числа теоретических тарелок N’ и величина H'- отношение достигаемой высоты эквивалентной теоретической тарелки к среднему диаметру частицы сорбента. Что касается формы частиц, то и в случае частиц сорбента нерегулярной формы достижимы эффективности не меньшие, чем в случае частиц сферической формы. Это объясняется тем, что частицы нерегулярной формы могут быть упакованы более плотно, чем сферические. Однако при прочих равных условиях колонки, заполненные сферическими частицами, имеют лучшую проницаемость.