
- •Оглавление
- •Основная литература
- •Дополнительная литература
- •Тематический план лекций для до
- •Тематический план лекций для озо
- •План лабораторных занятий для озо
- •Возможные темы рефератов
- •Занятие 1. Организация работ в лаборатории
- •Правила выживания в лаборатории
- •1.2. Дополнительная литература
- •1.4. Вопросы для самоконтроля
- •1.5. Задание на дом
- •Занятие 2. Вода, ее свойства и методы измерений рН
- •2.1. Физико-химические свойства и роль воды в биосфере
- •2.2. Дополнительная литература
- •2.3. Экспериментальная часть
- •2.3.1. Приготовление ацетатных буферных растворов
- •2.3.3. Электрометрические измерения
- •2.4. Вопросы для самоконтроля
- •2.5. Задание на дом
- •Занятие 3. Типы, дозировка и способы анализа растворов
- •3.2. Дополнительная литература
- •3.3. Экспериментальная часть
- •3.3.3. Сравнительный качественный анализ аминокислот
- •3.4. Вопросы для самоконтроля
- •3.5. Задание на дом
- •Занятие 4. Методы спектроскопии в анализе биомолекул и клеток
- •4.2. Дополнительная литература
- •4.3. Экспериментальная часть
- •4.3.2. Определение концентрации гемоглобина (Hb) в крови
- •4.3.3. Определение количества эритроцитов в крови с помощью турбидиметрии
- •4.4. Вопросы для самоконтроля
- •4.5. Задание на дом
- •Занятие 6. Основные приемы препаративной биохимии
- •6.2. Дополнительная литература
- •6.3. Экспериментальная часть
- •6.3.2. Разделение гемоглобина и теней эритроцитов
- •6.3.3. Высаливание белковых фракций плазмы крови и их
- •6.4.Вопросы для самоконтроля
- •6.5. Задания на дом
- •Занятие 7. Методы количественного анализа белков
- •7.2. Дополнительная литература
- •7.3. Экспериментальная часть
- •7.3.1. Количественное исследование белковых фракций крови биуретовым методом
- •7.4. Вопросы для самоконтроля
- •7.5. Задание на дом
- •Занятие 8. Деление молекулярных смесей методами хроматографии
- •8.2. Дополнительная литература
- •8.3. Экспериментальная часть
- •8.3.1. Хроматография аминокислот и пептидов на бумаге
- •8.3.2. Гель-хроматография смеси на колонке Сефадекса g – 50
- •8.4. Вопросы для самоконтроля
- •8.5. Задание на дом
- •Занятие 9. Итоговое № 1. Статическая
- •9.2. Задание на дом
- •Занятие 10. Разделение биополимеров методами электрофореза
- •10.2. Дополнительная литература
- •10.4. Вопросы для самоконтроля
- •10.5. Задание на дом
- •Занятие 11. Количественный анализ и свойства ферментов
- •11.2. Дополнительная литература
- •11.3. Экспериментальная часть
- •11.3.1. Получение разведенного препарата амилазы слюны
- •11.3.2. Количественное определение активности амилазы слюны способом Вольгемута
- •11.3.3. Выявление специфичности амилазы
- •11.3.4. Зависимость активности амилазы от температуры
- •11.3.4. Зависимость активности амилазы от величины рН инкубационной смеси. 1. В соответствии с таблицей протокола опыта,
- •11.4. Вопросы для самоконтроля
- •11.5. Задание на дом
- •Занятие 12. Брожение как модель изучения процессов метаболизма
- •12.2. Дополнительная литература
- •12.3. Экспериментальная часть
- •12.3.2. Количественное определение ортофосфата
- •12.4. Вопросы для самоконтроля
- •12.5. Задание на дом
- •Занятие 13. Углеводы. Методы определения и диагностическая роль глюкозы
- •13.2. Дополнительная литература
- •13.3. Экспериментальная часть
- •13.3.1. Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в био-жидкостях с помощью тест-наборов фирмы Lachema (Чехия)
- •12.3.2. Определение глюкозы в крови с помощью экспресс-анализатора Эксан-г (Литва)
- •12.3.3. Определение глюкозы в крови с помощью автономного экспресс-измерителя пкг-02-«Сателлит» (Россия)
- •13.4. Вопросы для самоконтроля
- •13.5. Задание на дом
- •Занятие 14. Основы химии и метаболизма липидов и биомембран
- •14.2. Дополнительная литература
- •14.3 Экспериментальная часть
- •14.3.2. Метод определения общего холестерола в биожидкостях, с помощью тест-набора реагентов «Новохол» (зао «Вектор-Бест»)
- •14.4. Вопросы для самоконтроля
- •14.5. Задание на дом
- •Занятие 16. Основы метаболизма азотистых соединений
- •Варианты азотистого баланса
- •Потребность животных в аминокислотах (По р. Марри и др., 1993, с изменениями)
- •16.2. Дополнительная литература
- •16.3 Экспериментальная часть
- •16.3.1. Определение количества мочевины в биожидкостях с помощью тест-набора фирмы Lachema (Чехия)
- •16.3.2. Определение концентрации креатинина в биожидкостях с помощью тест-набора фирмы Lahema (Чехия)
- •16.4. Вопросы для самоконтроля
- •16.5. Задания на дом
- •Занятие 17. Семинар по интеграции метаболизма
- •17.2. Темы реферативных сообщений
- •17.3. Обсуждение рефератов
- •17.4. Задания на дом
- •Занятие 18. Контрольные вопросы к итоговому № 2. Способы управления метаболизмом
- •Приложение
1.5. Задание на дом
1.5.1. Чем различаются элементные составы планеты Земля и биосферы?
1.5.2. В соответствии с шаблоном, опишите основные группы биогенных элементов:
1.5.3. Объясните понятие «органогены» и укажите их роль в биосфере.
1.5.4. Объясните понятие «макроэлементы» и укажите их роль в жизнедеятельности.
1.5.5. Объясните понятие «микроэлементы». Какова их роль в клетках и организмах?
1.5.6. Опишите важнейшие физико-химические свойства воды и, по возможности, их связь с биологическими функциями клеток.
1.5.7. Охарактеризуйте понятие «растворы». Как их можно классифицировать?
1.5.8. Чем отличается гидратация веществ от их растворения в воде?
1.5.9. Чем объяснить высокую способность воды к растворению веществ?
1.5.10. Что означает термин «диссоциация молекул». От чего она зависит и как влияет на свойства раствора?
1.5.11. Чем различаются свойства и как выражают концентрации растворов неэлектролитов и электролитов?
1.5.12. Определите понятие рН и опишите влияние этой величины на свойства молекул растворенных веществ.
1.5.13. Определите понятие «буферный раствор» и укажите их состав и свойства.
1.5.14. Определите понятия «осмос» и «осмотическое давление» растворов.
1.5.15. Какие теории появления жизни на Земле Вам известны?
1.5.16. Объясните достоинства и недостатки абиогенной теории зарождения жизни на Земле.
1.5.17. Опишите характер основных стадий биопоэза и возможные доказательства эволюции биосферы.
1.5.18. Чем объяснить зарождение жизни в восстановительной атмосфере слабосоленой воды отмелей?
1.5.19. Чем объяснить высокое содержание воды в клетках?
1.5.20. Какие буферные системы клеток и организмов Вам известны?
1.5.21. Определите роль и место биохимии в системе естественных наук. Чем она отличается от биоорганической химии и молекулярной биологии?
Занятие 2. Вода, ее свойства и методы измерений рН
2.1. Физико-химические свойства и роль воды в биосфере
Вода так распространена на Земле, что обычно считается безвредной инертной жидкостью, удобной для разных практик. В биосфере же, она составляет ~ 65 % массы клеток. Т.о., лишь около 1/3 их массы приходится на т. н. «сухое вещество». Известно, что высокая электроотрицательность атома О и низкая – Н, делает химически стабильные молекулы воды диполями, способными к образованию Н-связей и, реже, к диссоциации на протон (Н+) и гидроксил (ОН-). Это так отличает свойства воды от молекул с близкой массой: Н2, СН4, NH3, СО2 и низших органических растворителей, что вызывает ряд дискурсов = логических цепей физико-химических и биологических следствий (рис. 2.1).
Рис. 2.1. Биологические следствия структуры и свойств воды
Обратимая диссоциация молекул воды вызывает появление в ней ионов Н+ и ОН-, как и все ионы, покрытых многослойными ги-дратными оболочками. Хотя при 25 С, ионизируется лишь одна из 107 ее молекул, эта слабая склонность к ионизации делает настолько существенной роль Н+ и ОН- в физико-химических и биологических процессах, что ее выражают количественно: ионным произведением воды (Кw ), численно равным 1,0 .10-14. При равенстве концентраций Н+ и ОН-, в более чистой, чем дистиллят воде, раствор считают нейтральным, а его рН = 7. Этот показатель возник из выражения: рН = lg1/[H+] = -lg [H+], где –lg = р. Как видно из схемы (рис. 2.2) в кислом и щелочном диапазонах, сдвиги концентраций Н+ и ОН- всегда взаимозависимы = реципрокны, но, т.к. шкала рН логарифмическая, то ее сдвиг на 1 соответствует изменениям концентрации ионов в 10 раз!
Рис. 2.2. Примеры величин рН обще-распространенных жидкостей
(Ленинджер, 1985) |
Вода – значительно лучший растворитель, чем другие известные жидкости. В ней растворяются, как сильные кислоты и основания = В, так и кристаллические решетки многих солей, а также, частично диссоциирующие ионо-генные группы слабых органических кислот, В: аминов, амидов, азотистых гетероци-клов и их полимеров. Количество электролитов в растворе выражают их молекулярной массой: ммоль/л или способностью соединяться с разноименными ионами: мэкв/л.
|
|
В последнем случае, мэкв анионов и катионов всегда равны. В воде также растворимы электронейтральные оксосоединения диаметром 0,3-0,5 нм, включая низшие альдегиды, кетоны и спирты, вплоть до олигоз.
Еще
один класс растворимых в воде веществ
– амфипатиче-ские = дифильные молекулы,
имеющие наряду с полярными = ги-дрофильными
и неполярные = гидрофобные группы. Их
простейшая модель – мыла, то есть
натриевые и калиевые соли высших (n
= 12-22 С) жирных кислот, молекулы которых,
на схемах обычно изображают «хвостатым»
кружком, символизируя, соответственно,
полярную головку и, термодинамически
выгодную, растянутую конформацию
углеводородной цепи. В водных растворах,
их полярные головы ориентированы наружу
для образования Н-связей с молекулами
воды. Напротив, неполярные хвосты скрыты
внутри сферических агрегатов = мицелл,
где контактируют между собой с помощью
гидрофобных взаимодействий. Такая
структура позволяет мицеллам иметь
переменный состав и относительно крупные
размеры, придавая их коллоидным растворам
мутность мыла, непрозрачность молока
или млечных соков растений. Важно
отметить, что мицеллы обычно играют
транспортную роль в межклеточных
пространствах и сосудах, тогда как
основные коллоиды клеток – структурированные
растворы молекул белков и РНК, как
основных типов «молекулярных машин»,
имеют средний диаметр 4-10 нм.
Рис. 2.3. Схема влияний рН раствора на свойства и поведение биомолекул и агрегатов
Среди биомолекул нередки соли, а слабые кислоты и В, встречаются гораздо чаще сильных. Поэтому на рис. 2.3 дана схема дис-курса влияний величины рН растворов на структуру и активность ионогенных групп растворенных веществ. Очевидно, что эти воздействия так велики, что в лабораторной практике, за грубый критерий чистой воды принято ее сопротивление < 4 Ом. В биохимии и смежных практиках, измерения рН – одна из самых частых и важнейших процедур подготовки к анализам.
Поскольку вода для клеток не только наполнитель и основной растворитель, но и реакционная среда, она находится в них в двух формах: свободной (до 95 %) и связанной с фибриллярными структурами цитоскелета и пр. (4-5 %). Большинство биохимических ре-акций в водных растворах происходит между полярными молекулами, причем свободная вода может быть, как их участником, так и продуктом. Но, т. к. основой гидратации и растворения всех молекул служит изменение Н-связей водных кластеров, оно сдвигает и 4 важнейших физических константы воды: температуры замерзания и кипения, давление пара над раствором и осмотическое давление. Так как знание концентраций растворов позволяет предсказать количественные сдвиги этих констант, их объединяют понятием кол-лигативные = взаимосвязанные свойства. Именно они и позволяют водным видам существовать при температурах ниже 0 С!
До недавнего времени считалось, что из-за своих малых размеров, молекулы воды могут «проскальзывать» в клетки между сравнительно крупными молекулами мембранных фосфолипидов. Но, в 1988 г. Питер Эгр (Peter Agre) с коллегами выделил из мембран эритроцитов и проксимальных почечных канальцев, а позже подробно охарактеризовал мембранный белок-канал, названный аквапорин-1 (AQP1). Его тетрамер и образует полярную пору, способную проводить 3·109 молекул воды/с. Как теперь известно, аква-порины – обширное семейство белков всех без исключения плазматических мембран = ПМ и жестких клеточных оболочек = стенок прокариот, простейших, грибов и растений. Их физиологическая роль особенно заметна в таких функциях клеток, как поддержание осмотического давления, всасывание воды клетками корней растений и ее реабсорбция почкой животных, фильтрующих у человека ~150-200 л воды/сутки.
Поэтому в первом приближении, у многоклеточных организмов различают 2 водных пространства = компартмента: внутри- и внеклеточное. Первое из них относительно постоянно, т.к. ограничено ПМ, удерживающей в клетке большинство ее компонентов. Напротив, количество внеклеточной воды сильно зависит от возраста, пола и числа сравнительно бедных ею, белых и бурых жировых клеток, соответственно липо- и адипоцитов. Поэтому рост количества жировых клеток снижает содержание воды у многоклеточных животных. В связи с репродуктивной ролью, в массе тела самок на 5-10 % больше жира, чем у самцов и, соответственно – меньше воды (табл. 2.1).
Таблица 2.1
Динамика содержания воды в массе тела людей
(По М. М. Горн и др., 2000)
Из таблицы 2.2 видно, что перемещение растворенных в воде веществ основано на физико-химических принципах. Но их проявления сильно зависят, как от размеров и степени полярности самих биомолекул, так и от свойств гидрофобных биомембран и, таких надклеточных структур, как стенки капилляров и слои эпителиев, объединяемых понятиями гистогематических барьеров и барьерной функции.
Таблица 2.2
Основные механизмы перемещения молекул водных растворов в клетках и надклеточных системах
Очевидно, что избирательная = селективная проницаемость каналов транспорта молекул воды и порядка 50 типов ионных каналов, защищает все клетки от внешних воздействий, в то же время обеспечивая их связь с внешней средой и такие важные процессы, как создание мембранных потенциалов, секреция, мышечное сокращение и нейронная сигнализация. С нарушениями структуры и функций канальных белков связаны многие, в том числе, пока неизлечимые болезни. За фундаментальные открытия, связанные со структурой и функцией этих молекулярных машин, Нобелевская премия 2003 г. по химии присуждена Р. Мак-Киннону (Roderick MacKinnon) и П.Эгру (Peter Agre). По мнению экспертов, доказательства роли каналов сравнимы с достижением Уотсона и Крика, предложивших модель структуры ДНК.
Кроме транспортных механизмов клетки (табл. 2.2) и характера распределения их белков в ПМ, на проницаемость тканей для воды и ионов неизбежно влияют форма и плотность расположения клеток, выраженность у них полюсов, базальных мембран и межклеточных контактов. Крайними примерами этих свойств могут служить одиночный, веретенообразный фибробласт и гематоэнце-фалический барьер, с максимально известной плотностью расположения эндотелиоцитов.
Комбинации этих свойств в разных тканях, обеспечивающие надежность питания, межклеточной сигнализации и выведения из клеток конечных метаболитов, вынуждают различать у позвоночных 3 типа внеклеточных водных пространств:
1. Интерстициальная жидкость – водное окружение гликокаликса клеток, включая лимфу. У взрослых людей – 11-12 л. У новорожденных, относительно массы тела, ее примерно вдвое больше.
2. Внутрисосудистая жидкость – независимо от возраста ~7 % массы тела. От интерстициальной жидкости, пространство сосудов отграничено стенкой капилляров, образованной эндотелиоцитами и, секретированным ими же межклеточным веществом.
3. Трансцеллюлярные жидкости специализированных полостей тела: внутриглазная, спинномозгового канала, перикарда, плевры, синовиальная, пищеварительных соков и др. Их суммарный объем у человека – около 1 л. От интерстиция и внутрисосудистых пространств, их отделяют слои соответствующих эпителиев, обновляющих жидкости 6-8 раз в сутки с помощью механизмов секреции и реабсорбции.
Для примера, в таблице 2.3 дано распределение важнейших ионов в водных компартментах позвоночных животных. Очевидно, что этот перечень можно продолжить ионами Ca2+, Mg2+, SO42- и низкомолекулярной органикой: глюкоза, лактат, цитрат, аминокислоты, мочевина и др., вплоть до белков, сконцентрированных в клетках и плазме крови.
Таблица 2.3
Распределение ионов (мэкв/л) в водных пространствах человека
(По М. М. Горн и др., 2000, с изменениями).
Известно, что меру способности раствора создавать осмотическое давление, влияя тем самым на скорость движения воды, называют осмоляльностью. Ее выражают в миллиосмолях на кг воды (мОсм/кг), где 1 осмоль содержит 6 х 1023 частиц. Отсюда осмо-ляльность также определяют, как меру концентрации жидкостей или соотношение растворенных веществ и воды. Другой способ оценки концентраций растворов – осмолярность, т.е. количество частиц в 1 л раствора (мОсм/л). Но, так как водные биожидкости относительно разбавлены, то разница между осмоляльностью и осмолярностью невелика и, эти термины часто применяют, как взаимозаменяемые.