7.4. Вопросы для самоконтроля

7.4.1. Почему в биохимической практике, количественному определению белка придают первостепенное значение?

7.4.2. Какие физические принципы могут лежать в основе количественного определения белков?

7.4.3. Из каких соображений нужно исходить, выбирая метод количественного определения белка?

7.4.4. На каком принципе основан биуретовый метод определения количества белка в растворах?

7.4.5. Чем объяснить обилие модификаций биуретового метода?

7.4.6. Какие опасности возможны при определении белка биуретовым методом и, как их минимизировать?

7.4.7. Что применяется в биуретовом методе в качестве контрольного образца и почему?

7.4.8. С какой целью и как строят калибровочные графики проб стандартного ряда, в частности, для определения концентраций белка биуретовым методом?

7.4.9. Какими должны быть аминокислотный состав и физико-химические свойства белков цитоплазмы и плазмы крови, чтобы функционировать при физиологическом значении рН = 7,36?

7.4.10. Чем объяснить растворимость большинства белков крови в физрастворе, а то и дистилляте и, необходимость растворения теней эритроцитов в 1н. NaOH?

7.4.11. Что вы знаете о происхождении, структуре, свойствах и функциях СА?

7.4.12. Что вы знаете о происхождении, свойствах и функциях глобулиновых фракций плазмы крови?

7.4.13. Что вы знаете о количественном распределении белковых фракций плазмы крови?

7.5. Задание на дом

7.5.1. При оформлении протокола и подготовке к занятию 8 определите понятие «мононуклеотид».

7.5.2. Объясните, чем различаются мононуклеотиды по структуре, свойствам и функциям? Чем объяснить необходимость их номенклатуры и кодирования?

7.5.3. Как возникают 5’-5’ и 5’-3’ фосфодиэфирные связи в ди- и олигонуклеотидах? Какие следствия вытекают из этих различий?

7.5.4. Дайте определение и опишите общие физико-химические свойства полинуклеотидов.

7.5.5. В соответствии с шаблоном, заполните таблицу сравнения

7.5.6. Приведите примеры морфологических структур, являющихся нуклеопротеидами по своему составу. Каковы их функции в клетках?

7.5.7. Организация и эволюция геномов и молекулярно-генетиче-ских систем управления = МГСУ у вирусов, прокариот и эукариот.

7.5.8. Какие методы изучения моно- и полинуклеотидов вам известны?

7.5.9. В чем состоит гибридизация нуклеиновых кислот и, какую роль в геносистематике играет этот метод?

7.5.10. Технологии рекомбинантных ДНК и генномодифицированные организмы.

7.5.11. Роль полимеразной цепной реакции = ПЦР в изучении геномов и диагностике болезней.

Занятие 8. Деление молекулярных смесей методами хроматографии

8.1. Общие замечания. Известно, что основоположник хроматографии М. С. Цвет (1872 – 1919) разделил экстракт пигментов растений (1903) по их сорбции на колонке каолина = белой глины. Т.к. в потоке элюента = жидкости, фильтрующейся через носитель, скорости движения компонентов разделяемых смесей обратны степени их сорбции, Arne Tiselius (1902 – 1971, Швеция) предложил термин «сорбционный анализ» и, стал делить смеси, в зависимости от времени прохождения элюента через колонку или тонкий слой сорбента с развитой поверхностью.

Теоретические основы ионообменной, адсорбционной, распределительной и других видов хроматографии рассмотрены в курсах аналитической и физической химии. Но, т.к. при делении биомолекул, часто одновременно реализуется несколько механизмов, то, не вдаваясь в типы носителей, отметим, что геометрия сорбционного слоя и зависящее от него аппаратное оформление неподвижной фазы, дали ряд вариантов хроматографии (рис 8.1).

Рис. 8.1. Схема методов хроматографии

При плоскостных методах, 1-10 мкл смеси разделяемых веществ наносят на бумагу или тонкий слой сорбента, закрепленный на стекле или фольге. Носитель помещают во влажную, чаще стеклянную камеру с элюентом - смесью двух частично смешивающихся жидкостей. За десятки минут элюент перемещается по сорбенту под действием капиллярных сил и гравитации. При этом одна из жидкостей фиксируется на сорбенте, образуя неподвижную фазу, а другая – подвижная, проходит по нему с большей скоростью. В соответствии со степенью растворимости в той или иной части элюента, компоненты смеси распределяются по хроматограмме.

Независимо от принципа деления компонентов, колоночная хроматография возможна вручную, но гораздо удобней специальные приборы – хроматографы. Обычно, при помощи насоса на вход их колонок подают, как разделяемую смесь, так и элюент. А на выходе – размещают детектор, который, независимо от конструкции, в автоматическом режиме непрерывно отражает на диаграмме регистрации = хроматограмме, время выхода и концентрации компонентов в элюате. Варианты колоночной хроматографии (рис. 8.1) отличаются друг от друга не так диаметром, длиной колонки и типом носителя, как очередностью подачи в нее элюента и разделяемой смеси. Преимущество проявительной хроматографии состоит в том, что колонка не требует регенерации, а зоны компонентов анализируемой смеси – разделяются слоями элюата.

Из таблицы 8.1 видно, что в соответствии с агрегатным состоянием подвижной фазы, различают газо-жидкостную = ГЖХ и жидкостную хроматографию. Последняя – наиболее разнообразна, т.к. включает в себя фильтрацию в гелях, аффинную и высокоэффективную жидкостную хроматографию = ВЭЖХ, больше известную как HPLC = High pressure liquid chromatography, то есть хроматография под давлением. Т.о., все разнообразие методов хроматографии, как совокупности научных и производственных технологий в разных областях химии, медицины, экологии и т.д., основано на различиях в скоростях движения концентрационных зон компонентов изучаемых смесей, смещающихся относительно сорбента в потоке подвижной фазы.

Таблица 8.1

Фазовые отношения в хроматографии