12.3.2. Количественное определение ортофосфата
методом Лоури-Лопеца
Принцип метода: Основан на образовании фосфомолибдатного комплекса (Н7[Р(Мо2О7)6] х nН2О), который восстанавливают гидрохиноном и др. до молибденовой сини, колориметрируя затем интенсивность окраски. Белки, мешающие определению Фн, предварительно удаляют из проб общепринятыми способами. Один из самых простых и чувствительных (35-50 нмоль Фн на пробу) – метод Лоури-Лопеца, где восстановитель – аскорбиновая кислота.
Ход работы: 1. За время инкубации системы брожения, каждая рабочая пара студентов маркирует 10 пробирок: 6 – для построения калибровочных проб и еще 4 – для разведенных центрифугатов.
2. В соответствии с таблицей 12.2, в пробирки 1-6 внести указанные объемы основного 10-4 М раствора Na2HPO4 х 2H2O и дистиллята.
Таблица 12.2
Калибровка растворов для определения неорганического фосфата = Фн
3. Получив у дежурных мерные колбы 1 – 4 с разведенными центрифугатами исследуемых проб, отобрать из каждой по 2,7 мл раствора и, соответственно перенести их в пробирки 7 – 10.
4. Получить у лаборанта свежеприготовленные 1 % растворы:
а) молибдата аммония (NH4)Mo7O24 х 4Н2О в 6 н серной кислоте; б) аскорбиновой кислоты в 0,0005 н растворе сульфата меди (CuSO4 х 5H2O).
5. Во все 10 рабочих пробирок добавить по 0,4 мл 1 % раствора молибдата аммония.
6. Точно через 5 мин, также во все пробирки добавить по 0,4 мл 1% раствора аскорбата и, тщательно перемешав пробы, оставить их точно на 20 мин на столе для развития окраски.
7. В соответствии с работой 4.3.1, прогреть ФЭК КФК-2.
8. Фотометрировать все 10 проб против воды, в кюветах на 5 мм и красном светофильтре, занося соответственно, результаты калибровки в таблицу 12.2, а исследуемых проб – в таблицу 12.3 протокола занятия.
9. По аналогии с работой 7.3, на основании данных таблицы 12.3 построить калибровочный график зависимости А = абсорбции раствора от концентрации Фн в пробах.
10. С помощью калибровочного графика и, с учетом разведения проб в 50 раз, рассчитать и внести в таблицу 12.3. концентрации Фн в инкубационной среде.
Таблица 12.3
Динамика убыли ортофосфата в инкубационной среде
в процессе брожения
11. По результатам опыта, построить график динамики убыли фосфата в процессе брожения и сделать выводы.
12.4. Вопросы для самоконтроля
12.4.1. Дайте современную формулировку понятия «брожение».
12.4.2. Какой процесс лежит в основе всех типов брожения?
12.4.3. Как объяснить блокирование процессов брожения при отсутствии неорганического фосфата в инкубационной среде?
12.4.4. Чем объяснить токсичность арсенатов для биоты?
12.4.5. Как блокирует гликолиз моноидуксусная кислота?
12.4.6. Чем различаются разные типы брожения? Приведите примеры их применения.
12.4.7. Как объяснить торможение процессов брожения в присутствии кислорода?
12.4.8. Чем объяснить образование CO2 и накопление этанола при спиртовом брожении?
12.4.9. На каком принципе основаны колориметрические методы определения неорганического фосфата?
12.4.10. Как выявить в воде и биожидкостях органические соединения фосфата?
12.4.11. Стандартное количество энергии (G0), необходимое для синтеза 1М АТФ из АДФ и Фн составляет 30 кДж. Вычислите количество свободной энергии, необходимое для синтеза АТФ в клетке печени, при их физиологических концентрациях, соответственно равных 3,5; 1,5 и 5,0 мМ.
12.4.12. Известно, что суточная норма питания здорового человека массой 70 кг составляет ~2000 ккал. Приняв эффективность окислительного фосфорилирования за 40%, рассчитайте соответствующее количество синтезируемых молекул АТФ.
12.4.13. Концентрация АТФ в мышцах составляет ~8 мМ. При интенсивной мышечной работе, она расходуется со скоростью 30 мкмоль/мин на 1 г мышечной ткани: а) на какое время хватит этого запаса АТФ спринтеру; б) на сколько позволит растянуть бег креатинфосфат, если его концентрация в мышцах составляет около 40 мкМ; в) почему возможен марафонский бег?
12.4.14. Чем объяснить, что в митохондриях бурого жира отношение Р/О составляет около 1? Какова его функция? Когда и у какого таксона, его легче обнаружить?