11.5. Задание на дом
11.5.1. При оформлении протокола и подготовке к занятию 12, расскажите об уровнях и методах изучения метаболизма.
11.5.2. Что Вы знаете о роли неорганических и органических соединений фосфатов в процессах жизнедеятельности?
11.5.3. Что Вам известно об организации общих и специфических путей метаболизма и принципах управления ими?
11.5.4. Попытайтесь определить термин «брожение».
11.5.5. Что Вы знаете о структуре, свойствах и функциях митохондрий и их компартментов?
11.5.5. Расскажите об амфиболической роли цикла лимонной кислоты, реакциях его пополнения и принципах контроля.
11.5.6. Расскажите об организации и биологической роли дыхательных цепей в митохондриях и других органоидах.
11.5.7. Как и за счет чего, возникает трансмембранный электрохимический потенциал протонов на внутренней мембране митохондрий?
11.5.8. Расскажите о механизме окисления водорода субстратов в эндогенную воду и роли адениловых нуклеотидов в окислительном фосфорилировании и дыхательном контроле.
11.5.9. Что Вы знаете о способах использования энергии, аккумулированной в клетках?
11.5.10. Особенности строения митохондрий и функция адипоцитов бурой жировой ткани.
11.5.11. Расскажите о понятии «гипоэнергетические состояния» и их возможных причинах.
11.5.12. Что Вы знаете о причинах и механизмах образования активных форм кислорода = АФК?
11.5.13. Что Вам известно о мишенях и способах защиты от АФК?
11.5.14. Что Вы знаете о механизмах неспецифической защиты от инфекций?
Занятие 12. Брожение как модель изучения процессов метаболизма
12.1. Вводные замечания. Процессы брожения применяют для получения хлеба, кисломолочных продуктов и других традиционных биотехнологий так давно, что переоценить их роль в развитии цивилизаций - невозможно. В середине XIX в., выполняя заказ виноделов, Луи Пастер нашел, что клетки дрожжей сбраживают сахар в этиловый спирт и СО2. Попутно он выявил и т.н. «эффект Пастера», то есть способность кислорода замедлять брожение. В 1897 г. Э. Бухнер доказал, что спиртовое брожение возможно и с помощью водного экстракта дрожжевых клеток. Затем обнаружили, что оно зависит от неорганического ортофосфата = Фн, исчезающего из среды по мере расхода глюкозы. Изолируя Е брожения, попутно идентифицировали гексозо- и триозофосфаты и, адениловые нуклеотиды.
Комбинации этих приемов с добавками ингибиторов Е, с целью накопления межуточных метаболитов, позволили к середине ХХ в. выделить и установить последовательность всех 11 реакций дрожжевого брожения. В частности, Гарден и Ионг нашли, что тио-ловый Е D-глицеральдегид-З-фосфат: НАД+-оксидоредуктаза (фос-форилирующая, КФ.1.2.1.12) = ГАФ-дегидрогеназа, окисляя альдогруппу D-глицеральдегид-З-фосфата = ГАФ, вводит в него Фн. Но, так как стандартная свободная энергия гидролиза этого продукта: 1,3-дифосфоглицерата = ДФГ более отрицательна, чем у АТФ, то в следующей, ДФГ-киназной реакции возникают условия для субстратного фосфорилирования, обеспечивая клетку молекулой АТФ. Так, концентрация Фн в среде брожения стала мерой активности и длительности этого процесса.
В итоге этих исследований возник ряд постулатов:
1. Брожение – процесс анаэробного окисления углеводов, к которому способен цитозоль любых клеток.
2. В основе брожения лежит гликолиз – линейная последовательность 10 реакций распада глюкозы до двух молекул пировиноградной кислоты = ПВК. Суммарно, их стехиометрию выражает уравнение:
3. Вероятность и тип брожения зависят от наличия в организмах генов, экспрессирующих Е входа в гликолиз и выхода из него. Поэтому сбраживать крахмал, гликоген, сахарозу и т.д. могут не только проростки семян, но и большинство организмов, имеющих эндо- или экзоамилазы, гидролизующие полиозы и олигозы до глюкозы. Напротив, к сбраживанию целлюлозы способны лишь редкие виды почвенных прокариот и грибы, имеющие соответственно, структурносвязанные и водорастворимые целлюлазы. Поэтому грибы охотно живут на древесине, а поведение и способность животных питаться растениями, зависят от эффективности их морфофункционального симбиоза с бактериями ЖКТ.
4. Конечный продукт, определяя тип брожения, тоже зависит от экспрессии генов Е утилизации ПВК и регенерации НАДН2. Так, при молочнокислом брожении, свойственном большинству клеток, лактатдегидрогеназа = ЛДГ, регенерируя НАД для повтора ГАФ-дегидрогеназной реакции, обратимо восстанавливает ПВК в конечный продукт: лактат или молочную кислоту = МК. В отличие от них, клетки дрожжей имеют мощную декарбоксилазу ПВК. Поэтому при спиртовом брожении выделяется СО2, а сброс водорода для регенерации НАД, уже на молекулу уксусного альдегида, восстанавливает ее до этанола. Аналогично, но при участии других Е заканчиваются и другие виды брожения, в том числе и пропионовокислое у жвачных. Подробней, эти вопросы обычно излагают в курсах микробиологии, зоотехники и пищевых биотехнологий.
Таблица 12.1 суммирует подходы, с помощью которых энзимология и динамическая биохимия, ныне объединенные в метаболиту, за 100 лет изучили свыше 2500 управляемых ферментных реакций. Подобно процессам брожения и роли гликолиза в них, расшифровка этих пространственно-временных событий, с их последующей группировкой в десятки центральных и периферических цепей и циклов, позволили понять принципы и механизмы управления, с помощью которых метаболизм обеспечивает веществом, энергией и информацией, структуру и функции всех клеток и организмов. В частности, одним из важнейших достижений классической биохимии стало представление об обмене веществ, как трехэтапной открытой системе сопряжения реакций катаболизма – распада биополимеров пищи и тела, с процессами анаболизма, то есть синтезом специфических биополимеров, обеспечивающих клеткам стационарные состояния, сенсорику, адаптацию, рост, размножение и развитие.
Глядя на схему (рис. 12.1) по часовой стрелке, видно, что цифры справа относятся к этапам катаболизма, а слева – к фазам анаболизма или биосинтезов. Понятно, что распад биополимеров до мономеров соответствующих классов (1) возможен как в клетках, так и внеклеточно.
Таблица 12.1
Иерархия препаратов и методов изучения метаболизма
(По R.K. Murray et al., 1990 с изменениями)
К сожалению, энергия разрушаемых связей при этом не аккумулируется, автоматически делая его источником теплопродукции. Внеклеточные, чаще гидролитические реакции этого этапа отвечают за пищеварение, сигнализацию и защиту от инфекций. Напротив, множество его внутриклеточных реакций, имеющих разные механизмы, связано с процессингом РНК и фолдингом белков, управляющих гомеостазом, пролиферацией и апоптозом = гибелью клеток. Исторически, анаэробной фазой распада моноз назвали их неполное окисление в цитозоле, в отличие от дыхания или аэробной фазы катаболизма углеводов, протекающей в митохондриях. Фактически же, в цитозоле до карбоновых кислот (2) анаэробно окисляется большинство мономеров (монозы, глицерол, аминокислоты), а в матриксе митохондрий (3) аэробно окисляются все карбоновые кислоты, включая и высшие жирные.
Рис. 12.1. Трехэтапная схема метаболизма (пояснения в тексте)
Очевидно, что взаимопревращения карбоновых кислот в цитратном цикле (3) матрикса митохондрий, завершают распад органики реакциями декарбоксилирования, с выделением СО2 и поставкой водорода в дыхательные цепи внутренних мембран митохондрий = ВММ. Именно здесь, продольный транспорт электронов к О2, влечет перенос протонов поперек ВММ, приводя к образованию трансмембранного потенциала = ΔμН. Затем, АТФ-синтаза или комплекс V ВММ, сопрягает канальный транспорт пары протонов на ион кислорода, генерируя молекулу АТФ и, образуя этим способом свыше 90 % эндогенной воды. Лишь теперь, транслоказа митохондрий может обменять вновь образованную АТФ на равное количество АДФ цитозоля, возникшую в ходе энергопотребляющих процессов, обеспечив т.о., энергией, все этапы (1-3) анаболизма клетки.
Изложенное позволило обобщить этап катаболизма (3) и анаболизма (1) в единый амфиболический процесс митохондрий, не только завершающий распад метаболитов, но и обеспечивающий начало их биосинтеза атомами углерода и энергией. Но, хотя по формальным признакам, стадии анаболизма 2 и 3, нередко сходны с реакциями стадий 1 и 2 катаболизма, они принципиально различны по источникам энергии и водорода, локализации ключевых Е в органоидах и способам автоматического контроля процессов. Это особенно заметно при сравнении простых реакций гидролиза биополимеров, со сложными, но надежными механизмами матричных биосинтезов нуклеиновых кислот и белков.
Вышеописанные достижения превратили классическую биохимию в нынешнюю молекулярно-клеточную биологию, способную к принципиально новым поточным технологиям массовой диагностики, сравнения геномов и протеомов, создания генномодифицированных организмов = ГМО, ликвидации ранее неизлечимых болезней и голода на планете. Одновременно они подтвердили эволюционное единство биоразнообразия и, с большой долей вероятности позволили судить о причинах и механизмах эволюции биосферы. Согласно современным взглядам, все нынешние клетки унаследовали гликолиз от пробионтов, зародившихся в водной среде, при тогда восстановительной атмосфере Земли и, гетеротрофно питавшихся органикой абиогенного происхождения. Размножение клеток и истощение пищевых ресурсов вызвали жесткую конкуренцию, резко меняя характер и ускоряя ход эволюции. Видимо, исключительным событием было появление бактериального фотосинтеза у пробионтов, способных к азотофиксации. Освободив хозяев от пищевой зависимости, фотосинтез сделал их автотрофами, но накопление в атмосфере кислорода, как побочного продукта, блокировало абиогенный синтез органики.
Кислород так усложнил жизнь первичных анаэробных хемотрофов, что большинство их вымерло, а до наших дней дожили лишь те археи, что нашли бескислородные среды в экстремальных условиях вулканов, горячих, кислых и глубинных вод, рассолов и болот. Зато, возникший в атмосфере озоновый экран, принципиально меняя ход эволюции, защитил уцелевших пробионтов от смертельно опасного УФО. Скорей всего, что, освоив окислительное фосфорилирование, часть пробионтов стала первичными аэробными эубактериями или вторичными гетеротрофами. Другие же пробионты, поглотив, но, не переварив их, вступили с вторичными гетеротрофами в симбиоз, сохранив как энергостанции, этих предков митохондрий нынешних эукариот. Видимо, так появились вторичные аэробы, развившиеся в царства животных и грибов. Наконец, третья часть пробионтов, «заключив союз», как с аэробными гетеротрофами, так и с первичными фотосинтетиками, сохранила последние как митохондрии и хлоропласты, от которых и пошло царство растений.