11.3.3. Выявление специфичности амилазы
1. В 2 маркированных пробирки поместить по 5 капель слюны, разведенной в 10 раз.
2. В одну из них добавить 10 капель 0,2 % раствора крахмала, а в другую – столько же 0,2 % раствора сахарозы.
3. Пометив свою пару пробирок, поместить ее на 10 мин для инкубации, в штатив водяной бани с качалкой, при 40 С (313 К) или подогреть на пламени.
4. Вынув пробирки из бани, для выявления в них сахаров с восстанавливающими свойствами, проделать с содержимым качественную реакцию Троммера. Для этого, соблюдая осторожность:
5. В обе пробирки добавить по 10 капель 10 % раствора едкого натра (NaОН), а затем – по 10 капель 1 % раствора сульфата меди (CuSO4).
6. Соблюдая правила нагрева посуды в пламени (п. 1.1.18), прокипятить содержимое обеих пробирок на тигле с сухим горючим, зарегистрировать результаты и, занести их в протокол опыта для последующего истолкования.
11.3.4. Зависимость активности амилазы от температуры
1. В 4 маркированных пробирки разлить по 2 мл 0,2 % раствора крахмала.
2. Разместить пробирки: № 1 – в чашке со льдом; № 2 – в штативе на лабораторном столе; № 3 – в водяной бане с качалкой при 40С и, № 4 – в кипящей водяной бане.
3. Для контроля хода гидролиза субстрата с помощью йодной реакции, поместить во все пробирки стеклянные палочки.
4. Через 5-7 мин, когда растворы субстрата примут окружающую температуру, во все пробирки добавить по 0,5 мл слюны, разведенной в 10 раз.
5. Для лучшего контакта Е с субстратом, перемешать содержимое пробирок.
6. Через 2 мин нанести на предметное стекло 4 отдельных капли раствора Люголя и, с помощью стеклянных палочек, смешать с ними по капле инкубационных смесей из пробирок.
7. Высушив палочку фильтровальной бумагой, вернуть ее в соответствующую пробирку и занести результаты йодного теста в протокол опыта, оформленный в виде таблицы:
8. Повторять пп. 6 и 7 каждые 2 мин, пока реакция с йодом на крахмал, не станет отрицательной.
9. Немедленно собрать все 4 пробирки в штатив и охладить их водопроводной водой.
10. Добавить по 1-2 капли раствора Люголя во все пробирки и перемешать содержимое.
11. Занести результаты йодной реакции в соответствующие графы таблицы и обдумать полученные результаты.
11.3.4. Зависимость активности амилазы от величины рН инкубационной смеси. 1. В соответствии с таблицей протокола опыта,
в 5 маркированных пробирок слить указанные объемы растворов фосфата натрия для получения буферных растворов с заданными величинами рН.
2. В каждую из пробирок добавить по 1 мл 0,2 % раствора крахмала и по 1 мл слюны, разбавленной в 50 раз.
3. Перемешав содержимое пробирок, поместить их в водяную баню с качалкой или термостат при 40 С (313 К) на 7-10 мин.
4. Вынув пробирки из бани = термостата, быстро охладить их водопроводной водой.
5. Добавить по 1-2 капле раствора Люголя и, тщательно перемешать содержимое.
6. Результаты опыта занести в таблицу протокола и, пользуясь схемой рисунка 2.3, сделать выводы.
11.4. Вопросы для самоконтроля
11.4.1. В чем, по вашему мнению, заключается функция катализаторов?
11.4.2. Сформулируйте представления о преимуществах биокатализа, по сравнению с небиологическими катализаторами.
11.4.3. Объясните природу и химический состав Е.
11.4.4. Объясните причины и механизмы высокой эффективности биокатализа.
11.4.5. По каким признакам можно судить о наличии того или иного Е? Каким термином выражают это понятие?
11.4.6. В каких основных и производных единицах выражают активность Е?
11.4.7. Какую химическую реакцию катализируют амилазы?
11.4.8. На примере амилазы слюны, сформулируйте принципиальные положения количественного анализа Е.
11.4.9. Что Вы знаете о кинетике и общих свойствах Е?
11.4.10. Что вы помните о классификации и номенклатуре Е и кофакторов ферментативных реакций?
11.4.11. Что значит понятие «термолабильность»? Объясните причины и характер зависимости ферментных реакций от температуры.
11.4.12. Объясните причины и характер зависимости ферментных реакций от величины рН.
11.4.13. Применительно к энзимологии, объясните термин «ингибиторы» и приведите примеры их применения.
11.4.14. Где, по вашему мнению, применимы знания и понятия энзимологии?
11.4.15. Сформулируйте представления об индикаторных ферментных реакциях.
11.4.16. Что такое ферментный анализ, где и для чего он применим?