11.2. Дополнительная литература
11.2.1. Номенклатура ферментов. – М.: ВИНИТИ, 1979. – 320 с.
11.2.2. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. – М.: Высшая школа, 1980. – 272 с.
11.2.3. Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: Мир, 1985. – 358 с.
11.2.4. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика. – М.: ФАИР-ПРЕС, 1999. – 720 с.
11.2.5. Плакунов В.К. Основы энзимологии. – М.: Логос, 2001. – 128 с.
11.2.6. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. – М.: Мир, 1989. В 2-х томах.
11.2.7. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. – М.: Мир, 2002. – 589 с.
11.3. Экспериментальная часть
Амилаза слюны (КФ 3.2.1.1) – простая и доступная модель, для освоения основных приемов работы с Е. Соответственно схеме (рис. 11.2), в физиологических условиях она ведет ступенчатый эндогидролиз α-1,4-гликозидных связей в полиозах. Об этом можно судить по убыли реакции с йодом или нарастанию восстанавливающей способности сахаров, содержащих свободный полуацетальный гидроксил, например, с помощью качественных реакций Троммера, Бенедикта и др.
Рис. 11.2. Схема ступенчатого гидролиза полиоз под действием эндоамилаз слюны и поджелудочной железы
11.3.1. Получение разведенного препарата амилазы слюны
1. Студент-доброволец или дежурный, ополоснув рот водой 2-3 раза, собирает в пробирку с воронкой до 4 мл слюны.
2. Под контролем лаборанта, отобрать точно 3 мл слюны из пробирки и перенести в мерный цилиндр на 50 мл.
3. Избегая вспенивания, осторожно добавить в цилиндр воды до метки 30 мл и перемешать раствор стеклянной палочкой.
4. Слить, а при необходимости фильтровать раствор в стакан, отметив разведение слюны в 10 раз.
5. 10 мл разбавленной в 10 раз слюны поместить в тот же цилиндр, довести его водой до верхней метки, пометив, как разведение в 50 раз.
6. Оба препарата амилазы предоставить для работы подгруппе студентов. Внимание! Во всех работах использовать препарат амилазы, с разведением в 10 раз и, лишь в работе 11.3.5, для выявления зависимости активности Е от рН, применить разведение в 50 раз.
11.3.2. Количественное определение активности амилазы слюны способом Вольгемута
Принцип метода: Основан на последовательном разведении препарата амилазы водой с помощью «переката», после чего во все пробирки добавляют равные количества субстрата: раствора крахмала и инкубируют их при постоянной температуре. Окончив инкубацию, останавливают процесс гидролиза и, с помощью раствора йода, как индикатора на крахмал, выявляют наличие субстрата в пробирках. Зависимость между этими величинами (Жеребцов и др., 2002) сведена в таблицу:
Ход работы: 1. В соответствии с протоколом опыта, оформленным в виде таблицы:
в 10 пронумерованных пробирок разлить точно по 1 мл воды.
2. Добавить в первую пробирку 1 мл слюны с разведением в 10 раз и, избегая вспенивания, хорошо перемешать раствор с помощью пипетки.
3. Той же пипеткой перенести 1 мл содержимого из первой пробирки во вторую, из второй – в третью и т.д., каждый раз, тщательно перемешивая их содержимое. Закончив «перекат», удалить из последней (десятой) пробирки 1 мл смеси.
4. Во все пробирки с полученной серией разведений слюны добавить точно по 2 мл 0,1 % раствора крахмала, тщательно перемешивая их содержимое.
5. Пометить свой штатив и поместить его в водяную баню с качалкой при 40 С (313 К), оставив для инкубации точно на 30 мин.
6. По истечении времени инкубации, вынуть свой штатив с пробирками из бани и, тут же охладить его водой из под крана, в течение 1-2 мин.
7. В каждую пробирку добавить по 1-2 капли раствора Люголя (1 % раствор йода в 2 % растворе иодида калия), в качестве индикатора на крахмал.
8. Содержимое пробирок перемешать и, наблюдая развитие окраски, занести результаты в таблицу протокола опыта.
9. Рассчитать активность амилазы (Е/л) в пробах по следующей формуле:
а – разведение слюны в последней пробирке с желтой окраской;
0,002 – количество грамм крахмала в пробе;
1000 – коэффициент пересчета миллилитров в 1 л;
30 – время инкубации в минутах;
60 – коэффициент пересчета минут в секунды.
10. Занести результаты расчетов в таблицу протокола.
В норме, активность амилазы в слюне человека 3-7 нкат/л. Однако, существенной диагностической ценности она не имеет.