8.2. Дополнительная литература

8.2.1. Справочник по физико-химическим методам исследования

объектов окружающей среды. Под ред. Г. И. Арановича и др. – Л.: Судостроение, 1979. – 648 с.

8.2.2. Лабораторное руководство по хроматографическим и смеж-ным методам в 2-х тт. / Под ред. В. Г. Берёзкина. – М.: Мир, 1982.

8.2.3. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. – М.: Наука, 1985. – 534 с.

8.2.4. Аффинная хроматография. Методы. – М.: Мир, 1988. – 278 с.

8.2.5. Зеленин К. Н. и др. Нобелевские премии по химии за 100 лет. – СПб.: Гуманистика, 2003. – 218 с.

8.2.6. http://www.krugosvet.ru/articles/114/1011465/print.htm

8.3. Экспериментальная часть

8.3.1. Хроматография аминокислот и пептидов на бумаге

Принципы метода: 1. Смесь двух частично смешивающихся жидкостей, одна из которых – вода, а другая – водонасыщенный органический растворитель, например фенол или н-бутанол, движутся по капиллярам бумаги с разными скоростями, т.к. полярная вода, связываясь с полярной же целлюлозой носителя, создает неподвижную фазу. Напротив, менее полярный органический растворитель движется по бумаге быстрей и служит подвижной фазой.

2. От обычной фильтровальной, хроматографическую бумагу отличает лишь большая (до 22 %) способность к связыванию воды.

3. В зависимости от направления движения смеси по носителю, различают одномерную радиальную, восходящую, нисходящую и двумерную хроматографию.

4. Соответственно структуре своих радикалов, α-аминокислоты и низкомолекулярные пептиды лучше растворяются в той или иной фазе элюента и, как вариант распределительной хроматографии, тоже движутся по носителю с разными скоростями.

5. Экспериментально найдено, что деление аминокислот и пептидов идет эффективней в трехкомпонентных системах растворителей, так как добавки кислот, оснований, спиртов и др., с одной стороны, повышают гидрофильность подвижной фазы, а с другой – изменяют диссоциацию кислых и основных групп компонентов разделяемой смеси.

6. Выявление = индикацию всех компонентов смеси ведут, опрыскав высушенную хроматограмму из пульверизатора, раствором нингидрина, флуорескамина или о-фталевого диальдегида. Два последних индикатора, в присутствии восстановителей образуют с первичными аминами флуоресцирующие продукты, повышая чувствительность метода до 10^-9 – 10^-11 моля.

7. Выявленные пятна идентифицируют сравнением со «свидетелями» = чистыми образцами изучаемых веществ и, с помощью расчета коэффициентов подвижности: Rf = a/b, где а и b, соответственно, расстояния в миллиметрах, пройденные веществом и фронтом растворителя. Для данной системы растворителей, величина Rf каждого компонента – const.

Ход работы:

1. Избегая вероятного проявления отпечатков собственных пальцев, кожа которых секретирует много свободных аминокислот, взять за ребра бумажный диск или квадрат хроматографической бумаги, стороны которого немного больше диаметра чашки Петри и, поместить его на чистый лист своей лабораторной тетради.

2. С помощью линейки и тонко отточенного простого карандаша, без нажима, разделить диск на 4 – 6 примерно равных секторов.

3. Исходя из толщины круглых карандашей – 8 мм, его острием сделать в центре диска отверстие диаметром 6-8 мм.

4. Отступив от края отверстия на 5-10 мм, в каждом секторе поставить заметные точки старта, учитывая, что графит, препятствует растеканию водных растворов! Сбоку обозначить точки цифрами 1, 2, 3 и т.д., а на краю или в углу листа, указать № или инициалы владельца хроматограммы.

5. Положить диск на керамическую поверхность стола и, заполняя соответствующие графы таблицы протокола, нанести капиллярами на точки старта по капле 0,4 % растворов смеси аминокислот и «свидетелей» – аланина, лейцина, лизина, глутаминовой кислоты и дипептида.

6. Пока влажные пятна хроматограммы высыхают на воздухе, свернуть из полоски фильтровальной бумаги шириной 10-15 мм «ножку» или «фитиль» и вставить его в отверстие диска.

7. Открыть чашку Петри с ~10 мл смеси растворителей н-бутанол : уксусная кислота : вода в соотношении 4:1:5 и положить на ее края высушенный диск, проследив, чтоб ножка погрузилась в смесь растворителей.

8. Прикрыть систему крышкой чашки Петри, засечь время начала хроматографии и периодически контролировать движение фронта растворителя по бумаге.

9. Дождавшись подхода растворителя к краям бумаги, снять крышку чашки Петри и, пинцетом уложить на нее влажный диск, отметив в протоколе температуру помещения и время хроматографии.

10. Удалив ножку, высушить хроматограмму в сушильном шкафу при 90-100 С, в течение 10 мин.

11. Опрыскать хроматограмму 0,2 % раствором нингидрина в 96 % этаноле и повторно высушить ее в течение 5 мин.

12. Измерить в мм расстояние, пройденное фронтом растворителя от точки старта и занести его в таблицу протокола занятия.

13. Промаркировав карандашом середину каждого пятна хроматограммы, измерить расстояния их пробега от точек старта, занося результаты в таблицу протокола.

14. Рассчитать для каждого из пятен величину коэффициента распределения = Rf и занести результаты в таблицу протокола занятия.

15. Подтвердить результаты идентификации пятен смеси аминокислот, сравнив их положения со «свидетелями».

16. По мере возможности сделать выводы о влиянии температуры среды на скорость хроматографии и, взаимосвязи структуры аминокислот с их подвижностью в данной системе растворителей.