6.5. Задания на дом

6.5.1. При оформлении протокола и подготовке к занятию 7 объясните, почему основным источником информации для диагностики состояний животных и людей, чаще всего служит кровь? В чем вы видите недостатки и достоинства ее применения?

6.5.2. Объясните понятие «гематокрит» и его диагностические возможности.

6.5.3. Чем объяснить легкость выделения из крови эритроцитов и сложность выделения прочих форменных элементов?

6.5.4. Чем объяснить разницу выделенных объемов гемоглобина и «теней» эритроцитов?

6.5.6. Что вы знаете о происхождении и функциях белков плазмы крови?

6.5.7. Чем различаются понятия «плазма» и «сыворотка» крови?

6.5.8. В соответствии со схемой 6-3, рассчитайте для каждого этапа затраты материала и его разведение. Обдумайте, насколько целесообразна подобная схематизация для предстоящих работ?

6.5.9. Исходя из молекулярной массы триптофана – 204 Да и его содержания в СА – 0,58%, рассчитайте минимальную массу бычьего сывороточного альбумина = БСА.

6.5.10. В соответствии с предложенным шаблоном, заполните таблицу, отразив известные вам сферы деятельности человека, связанные с методами определения количества белка:

6.5.11. Чем отличаются ферменты = энзимы = Е от небиологических катализаторов?

6.5.12. Какими методами изучают Е и, как измеряют их активность?

6.5.13. Что такое специфичность действия Е и в чем заключаются стадии биокатализа?

6.5.14. Что вы знаете о номенклатуре Е?

6.5.15. Попытайтесь суммировать роль ионов металлов и витаминов для биокатализа.

6.5.16. Объясните принцип действия конкурентных ингибиторов Е и степень их обратимости.

6.5.17. В соответствии с шаблоном, создайте и заполните таблицу классификации Е и их кофакторов:

6.5.18. Исходя из природы Е, объясните зависимости скоростей катализа от: рН среды, температуры, присутствия их активаторов и ингибиторов.

6.5.19. Объясните понятия: гомеостаз, компартментация, изоферменты и органоспецифичность Е.

6.5.20. Приведите примеры мультиферментных комплексов и метаболических путей, как способов организации работы Е в клетках.

6.5.21. Что вам известно о принципах аллостерической регуляции путей метаболизма, веществах-регуляторах и олигомерной структуре ключевых Е?

6.5.22. Объясните роль ковалентных модификаций Е в образовании ферментных каскадов на примерах внутриклеточных реакций фосфорилирования/дефосфорилирования и гликозилирования, а также избирательного протеолиза при свертывании крови и пищеварении.

6.5.23. Что вы знаете о семействах и роли в жизнедеятельности клеток белков теплового шока = БТШ = HSP, шаперонов и шаперонинов, циклинов и циклинзависимых протеиназ?

6.5.24. Попытайтесь создать схему применения Е и их ингибиторов в качестве индикаторов состояний, лекарств и пестицидов, аналитических реактивов и инструментов модификации молекул в различных сферах деятельности людей.

Занятие 7. Методы количественного анализа белков

7.1. Общие замечания. Известно, что белки составляют половину и более сухой массы большинства клеток. Пластичность их полипептидной структуры позволяет белкам играть роль главных «молекулярных машин» в любой клетке и организме. Наконец белки – важнейший источник азота в питании, а, следовательно, росте и развитии консументов. Поэтому определение белка играет первичную = опорную роль во всех количественных исследованиях по энзимологии и биологии клеток, служит основой оценки физиологии и патологии организмов и их популяций, а также – важнейшим критерием оценки качества = эффективности пищевых цепей.

Соответственно задачам и возможностям лабораторий, методы измерения концентрации белков (табл. 7.1) многочисленны и разнообразны. Очевидно, что рефрактометрия (лат. Refractus – преломление) позволяет быстро и просто определять процентные концентрации белка в двухкомпонентных растворах. Гравиметрия – зависит от чувствительности лабораторных весов и требует чистого препарата, высушенного до постоянной массы. Принцип и формула расчета фотометрии белков в УФ, уже приводились в таблице 4.3.

Таблица 7.1

Методы измерения концентрации белков

До 70-х гг. прошлого века, наиболее точным (10^-5 г/л), считалось определение белка по количеству азота. Исходя из того, что в подавляющем большинстве белков, за исключением гистонов и протаминов, содержание азота близко к 16 %, считалось достаточным умножить найденную величину на эмпирический коэффициент 6,25 и, получить содержание белка в препарате. Однако, необходимость минерализации препарата в серной кислоте и последующее определение аммиака, занимали часы-сутки. Из-за длительности и трудоемкости этих процедур, сейчас этот метод применяют редко. По близким причинам, измерение концентраций белка на основе анализа аминокислот, используют лишь в специализированных лабораториях.

С 50-х гг. ХХ в., чаще всего в биохимической литературе цитировали работу Lowry и соавторов, предложивших измерять концентрации белков сочетанием биуретовой реакции с реактивом Фолина-Чиокалто (1927), дающим интенсивную темно-синюю окраску с тирозином, фенилаланином и, меньше с такими аминокислотами, как Три, Гис, Цис. К сожалению, его линейность, сохраняется лишь в узком диапазоне концентраций. Большинство модификаций этой методики сводится к попыткам устранить влияние специфических реагентов, применявшихся при выделении белков. В последние годы появились методы связывания красителей и флуорометрии, если в белке имеется, или, без потери нативных свойств, в него вводится соответствующий маркер. Достоинства и недостатки этих методов сведены в таблицу 7.2.

Таблица 7.2

Сравнение достоинств и недостатков методов измерения количества белка (По Р. Скоупс, 1985 с изменениями)