6.3.3. Высаливание белковых фракций плазмы крови и их
количественная нефелометрия
Основаны на способности белков, в зависимости от прочности их гидратных оболочек, оседать из раствора при определенных концентрациях фосфатных солей. Степень помутнения растворов, определенная нефелометрией на ФЭКе КФК-2, пропорциональна содержанию белка в соответствующей фракции.
1л основного фосфатного буферного раствора содержит: 67 г. NaOH и 463,6 г. К3РО4. Соотношение объемов рабочих буферных растворов – в таблице 6.1.
Таблица 6.1
Состав рабочих буферных растворов.
1. В соответствии с таблицей 6.2 поместить в 6 пронумерованных центрифужных пробирок:
Таблица 6.2.
Состав проб, мл для высаливания белковых фракций плазмы
2. Пробы тщательно перемешать и, точно через 15 мин с момента добавки препаратов, измерить величины А растворов на ФЭКе с красным светофильтром, в кювете толщиной 5 мм против контроля. 3. Убедившись в надежной маркировке проб, плотно закрыть их пробками и сдать образца на хранение лаборанту для работы на следующих занятиях.
4. Для каждой фракции белков плазмы рассчитать истинное значение А по формулам: Сывороточный альбумин = СА = А3 - А4;
α–глобулины = А4 - А5;
β–глобулины = А5 - А6;
γ–глобулины = А6.
5. Полученные истинные значения А для всех фракций суммировать и, приняв найденную величину за 100 %, рассчитать по формуле:
В норме, плазма крови млекопитающих содержит 60-80 г/л белка, из которых 35-50 г/л СА и 25-30 г/л глобулинов. Т.е. отношение альбумина к глобулинам = индекс А/Г лежит в пределах 1,5-2,3. Отсюда, относительное содержание CА в плазме крови составляет 55%, α–глобулинов – 10-18%, β–глобулинов – 8-14% и γ – глобулинов – 12-22%. Данные величины, как важнейшие константы гомеостаза, изменяются лишь при тяжелых кровопотерях, воспалительных и инфекционных заболеваниях и, крайней степени белкового голодания – маразме.
6.4.Вопросы для самоконтроля
6.4.1. С позиций биологии, определите понятие «ткань».
6.4.2. Какие разновидности биотканей вам известны?
6.4.3. Определите понятие «дифферон» и приведите их примеры.
6.4.4. Можно ли биохимические методы анализа назвать неразрушающими?
6.4.5. Чем различаются основные подходы к биохимическому анализу и в чем состоит залог его успеха?
6.4.6. В чем могут заключаться подготовительные операции при биохимическом анализе?
6.4.7. В каком температурном режиме хранят материал и выделяют биохимические препараты?
6.4.8. Почему нет единого алгоритма для выделения биомолекул?
6.4.9. Сформулируйте основные этапы препаративной биохимии.
6.4.10. Назовите основные этапы диагностической биохимии.
6.4.11. Какие способы разрушения тканей и клеток вам известны?
6.4.12. Почему ткани животных разрушать проще, чем клетки прокариот и ткани растений?
6.4.13. Какими приемами удаляют из гомогенатов недостаточно разрушенный материал?
6.4.14. Какие принципы могут лежать в основе разделения смеси биомолекул?
6.4.15. Какие факторы нужно учитывать при экстракции или осаждении биополимеров из смеси?
6.4.16. Что такое «высаливание» и зачем оно применяется?
6.4.17. Какие методы применимы для удаления или замены низкомолекулярных веществ в гомогенатах?
6.4.18. Что такое «молекулярные сита» и на каком принципе основано их применение? Назовите синонимы этого метода?
6.4.19. Почему различия в фазовых переходах сравнительно редко применяются к разделению биомолекул?
6.4.20. Какие методы разделения макромолекул основаны на разнице в их размерах?
6.4.21. Что такое хроматография и, какие ее разновидности вам известны?
6.4.22. Что такое «изоэлектрическая точка» и чем она отличается от понятия «изоэлектрическое состояние»?
6.4.23. Что вы знаете об электрофорезе и, чем он отличается от изоэлектрофокусирования?
6.4.24. Какие способы концентрирования растворов вам известны?
6.4.25. Как убедиться в гомогенности и нативных свойствах препарата?