Занятие 6. Основные приемы препаративной биохимии
6.1. Общие замечания. Известно, что все организмы состоят, из клеток и продукта их жизнедеятельности = внеклеточного вещества. Причем прокариоты, простейшие и грибы, встречаются в виде отдельных клеток или их колоний. Многоклеточные же эукариоты, типа высших растений и животных, обычно состоят из множеств клеточных дифферонов, структурно сопряженных друг с другом в ткани, согласованные в своем метаболизме и жизненных циклах в интересах организмов, их популяций и сообществ. Залог успеха разрушающего биохимического анализа – рациональный выбор биообъекта, щадящие и верные приемы изъятия из организма образца ткани, его фиксации, хранения и обработки. Различия же в целях и методах анализа (рис. 6.1) проявились к началу ХХ в.
Рис. 6.1. Схема целей и этапов биохимических исследований
Изучение структуры и функций биомолекул потребовало их выделения и очистки до минимума примесей, а в идеале – до однородного состояния. Но быстрота разрушения части молекул, например, с функцией медиаторов, как и высокая вероятность денатурации белков, часто вынуждают хранить и вести выделение препаратов на холоде. Для извлечения = экстракции большинства белков из клеток животных, обычно достаточно механической гомогенизации в водной среде выделения. Разрушение же клеточных стенок растений и, особенно микроорганизмов, требует шаровых мельниц, ультразвука и других жестких приемов. Удаление из гомогенатов обрывков волокон, фрагментов клеточных структур и т.п., ведут с помощью их отстаивания, фильтрации или центрифугирования, а для удаления или замены низкомолекулярных веществ, пользуются диализом, ультрафильтрацией или молекулярными ситами. Трудоемкость процедур препаративной биохимии и обилие специфических терминов поясняет схема (рис. 6.2).
Рис. 6.2. Схема методов препаративной биохимии
Очевидно, что процесс выделения и очистки препарата почти неизбежно связан с его разбавлением, требующим потом, адекватного задаче концентрирования раствора. Часто для этого применяют высаливание белков, то есть их осаждение из раствора с помощью больших концентраций нейтральных солей: NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4 и т.д., в соответствии с положением ионов в ряду Гофмейстера. Этот прием основан на: 1) нейтрализации зарядов молекул белка с помощью противоионов и 2) обратимом разрушении их гидратных оболочек. Т.к. высаливание зависит от размеров и гидрофобности макромолекул, то глобулины плазмы крови оседают при 50 % концентрации сульфата аммония, а осаждение сывороточного альбумина = СА, требует его 100 % насыщения. Т.о., высаливание позволяет не только концентрировать целевой продукт, но и обеспечивает его дополнительную очистку. Осадки белков после этого, растворяют добавлением воды или повторным диализом, добиваясь 50-80 % концентрации препарата. Такой продукт называют сырцом и подвергают заключительным этапам очистки и проверки гомогенности, с помощью разных вариантов хроматографии и электрофореза.
Для диагностики состояний животных и людей, физиологи и врачи неоднократно пытались применять доступные покровные ткани, секреты и экскреты, но быстро убеждались в их ограниченной информативности. Поэтому, уже свыше 100 лет, основным источником информации служит химический анализ слюны, желудочного сока, желчи, молока и, особенно крови, получаемых с помощью малоболезненных и относительно простых и безопасных процедур. Понятно, что точность основных аналитических процедур, уже рассмотренных на предыдущих занятиях, зависит от правильного взятия проб, например, крови – натощак и т.д. и точного выполнения приемов хранения и подготовки материалов к анализу, в основном совпадающих с вышеописанными методами препаративной биохимии.
К сожалению, большинство диагностических лабораторий РФ, как и 100 лет назад, ведет эти анализы вручную, трудоемкими методами микроскопии и классической биохимии. Поэтому, относительно точные = эталонные результаты диагностических показателей выдаются через часы или сутки, а на их получение, идет свыше трети трудозатрат соответствующих лабораторий. Тем не менее, именно они дают от 80 до 100 % объективной и полезной информации о молекулярно-клеточном состоянии и системах управления внутренней средой организма.