
- •Оглавление
- •Основная литература
- •Дополнительная литература
- •Тематический план лекций для до
- •Тематический план лекций для озо
- •План лабораторных занятий для озо
- •Возможные темы рефератов
- •Занятие 1. Организация работ в лаборатории
- •Правила выживания в лаборатории
- •1.2. Дополнительная литература
- •1.4. Вопросы для самоконтроля
- •1.5. Задание на дом
- •Занятие 2. Вода, ее свойства и методы измерений рН
- •2.1. Физико-химические свойства и роль воды в биосфере
- •2.2. Дополнительная литература
- •2.3. Экспериментальная часть
- •2.3.1. Приготовление ацетатных буферных растворов
- •2.3.3. Электрометрические измерения
- •2.4. Вопросы для самоконтроля
- •2.5. Задание на дом
- •Занятие 3. Типы, дозировка и способы анализа растворов
- •3.2. Дополнительная литература
- •3.3. Экспериментальная часть
- •3.3.3. Сравнительный качественный анализ аминокислот
- •3.4. Вопросы для самоконтроля
- •3.5. Задание на дом
- •Занятие 4. Методы спектроскопии в анализе биомолекул и клеток
- •4.2. Дополнительная литература
- •4.3. Экспериментальная часть
- •4.3.2. Определение концентрации гемоглобина (Hb) в крови
- •4.3.3. Определение количества эритроцитов в крови с помощью турбидиметрии
- •4.4. Вопросы для самоконтроля
- •4.5. Задание на дом
- •Занятие 6. Основные приемы препаративной биохимии
- •6.2. Дополнительная литература
- •6.3. Экспериментальная часть
- •6.3.2. Разделение гемоглобина и теней эритроцитов
- •6.3.3. Высаливание белковых фракций плазмы крови и их
- •6.4.Вопросы для самоконтроля
- •6.5. Задания на дом
- •Занятие 7. Методы количественного анализа белков
- •7.2. Дополнительная литература
- •7.3. Экспериментальная часть
- •7.3.1. Количественное исследование белковых фракций крови биуретовым методом
- •7.4. Вопросы для самоконтроля
- •7.5. Задание на дом
- •Занятие 8. Деление молекулярных смесей методами хроматографии
- •8.2. Дополнительная литература
- •8.3. Экспериментальная часть
- •8.3.1. Хроматография аминокислот и пептидов на бумаге
- •8.3.2. Гель-хроматография смеси на колонке Сефадекса g – 50
- •8.4. Вопросы для самоконтроля
- •8.5. Задание на дом
- •Занятие 9. Итоговое № 1. Статическая
- •9.2. Задание на дом
- •Занятие 10. Разделение биополимеров методами электрофореза
- •10.2. Дополнительная литература
- •10.4. Вопросы для самоконтроля
- •10.5. Задание на дом
- •Занятие 11. Количественный анализ и свойства ферментов
- •11.2. Дополнительная литература
- •11.3. Экспериментальная часть
- •11.3.1. Получение разведенного препарата амилазы слюны
- •11.3.2. Количественное определение активности амилазы слюны способом Вольгемута
- •11.3.3. Выявление специфичности амилазы
- •11.3.4. Зависимость активности амилазы от температуры
- •11.3.4. Зависимость активности амилазы от величины рН инкубационной смеси. 1. В соответствии с таблицей протокола опыта,
- •11.4. Вопросы для самоконтроля
- •11.5. Задание на дом
- •Занятие 12. Брожение как модель изучения процессов метаболизма
- •12.2. Дополнительная литература
- •12.3. Экспериментальная часть
- •12.3.2. Количественное определение ортофосфата
- •12.4. Вопросы для самоконтроля
- •12.5. Задание на дом
- •Занятие 13. Углеводы. Методы определения и диагностическая роль глюкозы
- •13.2. Дополнительная литература
- •13.3. Экспериментальная часть
- •13.3.1. Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в био-жидкостях с помощью тест-наборов фирмы Lachema (Чехия)
- •12.3.2. Определение глюкозы в крови с помощью экспресс-анализатора Эксан-г (Литва)
- •12.3.3. Определение глюкозы в крови с помощью автономного экспресс-измерителя пкг-02-«Сателлит» (Россия)
- •13.4. Вопросы для самоконтроля
- •13.5. Задание на дом
- •Занятие 14. Основы химии и метаболизма липидов и биомембран
- •14.2. Дополнительная литература
- •14.3 Экспериментальная часть
- •14.3.2. Метод определения общего холестерола в биожидкостях, с помощью тест-набора реагентов «Новохол» (зао «Вектор-Бест»)
- •14.4. Вопросы для самоконтроля
- •14.5. Задание на дом
- •Занятие 16. Основы метаболизма азотистых соединений
- •Варианты азотистого баланса
- •Потребность животных в аминокислотах (По р. Марри и др., 1993, с изменениями)
- •16.2. Дополнительная литература
- •16.3 Экспериментальная часть
- •16.3.1. Определение количества мочевины в биожидкостях с помощью тест-набора фирмы Lachema (Чехия)
- •16.3.2. Определение концентрации креатинина в биожидкостях с помощью тест-набора фирмы Lahema (Чехия)
- •16.4. Вопросы для самоконтроля
- •16.5. Задания на дом
- •Занятие 17. Семинар по интеграции метаболизма
- •17.2. Темы реферативных сообщений
- •17.3. Обсуждение рефератов
- •17.4. Задания на дом
- •Занятие 18. Контрольные вопросы к итоговому № 2. Способы управления метаболизмом
- •Приложение
4.3.2. Определение концентрации гемоглобина (Hb) в крови
гемиглобинцианидным методом
Принцип: Основный буферный раствор разрушает эритроциты, а феррицианид калия K3[Fe(CN)6] = красная кровяная соль, окисляет до трёхвалентного состояния атом Fe2+ гема гемоглобина = Нb. Возникший гемиглобин (Нi), или, по старой номенклатуре - метгемоглобин, реагирует с ацетонциангидрином:
с
образованием гемиглобинцианида, имеющего
стабильный максимум абсорбции при λ
540-546 нм, пропорциональный содержанию
Hb
в пробе. Метод общепринят в мировой
лабораторной прак-тике, как наилучший
по сочетанию параметров. Нормальное
содер-жание Нb
в крови женщин составляет: 115 – 145 г/л, а
мужчин: 132 – 164 г/л. Выпускаемые
промышленностью модели
гемоглобинометров,
обычно основаны на том же принципе
фотометрии, но имеют суженный диапазон,
соответствующий максимуму А
гемиглобинцианида.
Ход определения: В маркированную пробирку внести точно 5 мл трансформирующего раствора, содержащего нужные пропорции буфера, феррицианида калия и ацетонциангидрина. Затем, с помощью полуавтоматического дозатора, туда же добавить 20 мкл крови (Разведение в 251 раз). Полученной смесью многократно промыть наконечник дозатора и тщательно перемешать раствор. Пробирку оставить в штативе не менее чем на 10 мин.
Декантировать пробу в кювету ФЭКа, толщиной 10 мм и при зеленом светофильтре, против трансформирующего раствора, измерить А. Рассчитать концентрацию гемоглобина (г/л) в крови по формуле: А . 367,7, занести результат в протокол и сделать выводы.
4.3.3. Определение количества эритроцитов в крови с помощью турбидиметрии
Принцип метода: Многократное разведение нативной крови с антикоагулянтом, изоосмотическим раствором с физиологическим рН, делает суспензию эритроцитов относительно стабильной и прозрачной. Это позволяет, при максимально возможной λ ФЭКа, сочетать минимум поглощения энергии света с его максимальным рассеянием, клетками соизмеримого диаметра.
Ход определения:
1. Подготовить в штативе ряд из 7 маркированных пробирок.
2. С помощью мерных пипеток, внести в первую пробирку точно 4 мл, а в остальные – по 2 мл 0,85 % раствора хлорида натрия = физиологический раствор, с рН = 7,36.
3. Полуавтоматическим дозатором на 20 мкл внести в первую пробирку 2 объема (40 мкл) цельной крови. Многократно промыть наконечник дозатора полученной суспензией, тщательно перемешивая ее.
4. С помощью мерной пипетки, перенести из первой пробирки во вторую точно 2 мл суспензии и снова, тщательно ее перемешать.
5. Повторять операцию «переката», перенося точно по 2 мл суспензии и тщательно перемешивая вновь полученную, из второй пробирки в третью, из третьей в четвертую и т.д. Из последней пробирки, 2 мл суспензии слить в отходы.
6. Вращая рукоять на передней панели ФЭКа слева, установить красный светофильтр и, соответственно пп. 2 и 3 работы 4.3.1, убедиться в соответствии положения рукояти его чувствительности на передней панели справа.
7. Начиная с самой разбавленной пробы (пробирка 7) поочередно декантировать содержимое пробирок в кювету толщиной 5 мм и, замерив их абсорбцию против дистиллята или физраствора, занести результаты в таблицу 4.4 протокола опыта.
Таблица 4.4
Анализ серии растворов
8. Рассчитать серии разведений крови, полученных методом «переката».
9. Вычертить график зависимости между разведением проб (абсцисса) и абсорбцией (ордината), определив на нем линейный отрезок разведений, пригодных для счета эритроцитов по степени мутности растворов.
10. Если параллельно, с помощью эталонной микроскопии в камере Горяева, подсчитать содержание эритроцитов в исходном образце крови и разведенных пробах, можно заполнить последнюю строку в таблице 4.4. Соответственно, внеся нужные поправки, удастся построить аналогичный разбавлению калибровочный график, таблицу или простую компьютерную программу, для автоматического счета эритроцитов в разбавленных образцах крови. В частности, так построена калибровочная таблица лаборатории, по которой можно определить содержание эритроцитов в 1 мкл и, соответственно, в 1 л крови исследуемого образца.
11. Сделать выводы из эксперимента, учитывая, что нормальное содержание эритроцитов в крови женщин: 3 – 4,5 х 1012/л, а мужчин: 4 – 5,5 х 1012/л.
12. Пара студентов, завершающая фотометрию, оставив открытой крышку кюветного отделения ФЭКа, тумблером на задней панели слева, выключает прибор и вынимает его сетевую вилку из розетки.
13. Слив растворы из кювет, тщательно вымыть их изнутри и снаружи дистиллятом и, оставить вверх дном на фильтре. После чего, убрать рабочее место и сдать его лаборанту.