26. Превращение различных форм азота микроорганизмами. Аммонификация белков. Ассимиляционная и диссимиляционная нитратредукция. Аммонификация нитрата. Азотфиксация. Нитрификация.

Нитрифицирующие бактерии

Получают энергию в результате окисления восстановленных соединений азота (аммиака; азотистой кислоты). Впервые чистые культуры этих бактерий получил С. Н. Виноградский в 1892 г., установивший их хемолитоавтотрофную природу. В IX издании Определителя бактерий Берги все нитрифицирующие бактерии выделены в семейство Nitrobacteraceae и разделены на две группы в зависимости от того, какую фазу процесса они осуществляют. Первую фазу — окисление солей аммония до солей азотистой кислоты (нитритов) — осуществляют аммонийокисляющие бактерии (роды Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosolobus и др.):

NH₄⁺ + 1,5O₂ = NO₂ ^– + H₂O + 2H⁺.

Вторую фазу — окисление нитритов до нитратов — осуществляют нитритокисляющие бактерии, относящиеся к родам Nitrobacter, Nitrococcus и др.:

NO₂ ^– + 1/2O₂ = NO₃ ^– .

Группа нитрифицирующих бактерий представлена грамотрицательными организмами, различающимися формой и размером клеток, способами размножения, типом жгутикования подвижных форм, особенностями клеточной структуры, молярным содержанием ГЦ-оснований ДНК, способами существования.

Все нитрифицирующие бактерии — облигатные аэробы; некоторые виды — микроаэрофилы. Большинство — облигатные автотрофы, рост которых ингибируется органическими соединениями в концентрациях, обычных для гетеротрофов. Основным источником углерода остается CO₂, ассимиляция которого осуществляется в восстановительном пентозофосфатном цикле. Только для некоторых штаммов Nitrobacter показана способность к медленному росту в среде с органическими соединениями в качестве источника углерода и энергии.

Процесс нитрификации локализован на ЦПМ и внутрицитоплазматических мембранах. Ему предшествует поглощение NH₄⁺ и перенос его через ЦПМ с помощью Сu-содержащей транслоказы. При окислении аммиака до нитрита атом азота теряет 6 электронов. Предполагается, что на первом этапе аммиак окисляется до гидроксиламина с помощью монооксигеназы, катализирующей присоединение к молекуле аммиака 1 атома O₂; второй взаимодействует, вероятно, с НАДH₂, что приводит к образованию H₂O:

NH₃ + O₂ + НАДH₂ = NH₂OH + H₂O + НАД⁺.

Гидроксиламин далее ферментативно окисляется до нитрита:

NH₂OH + O₂ = NO₂ ^– + H₂O + H⁺.

Электроны от NH₂OH поступают в дыхательную цепь на уровне цитохрома c и далее на терминальную оксидазу. Их транспорт сопровождается переносом 2 протонов через мембрану, приводящим к созданию протонного градиента и синтезу АТФ. Гидроксиламин в этой реакции, вероятно, остается связанным с ферментом.

Вторая фаза нитрификации сопровождается потерей 2 электронов. Окисление нитрита до нитрата, катализируемое молибденсодержащим ферментом нитритоксидазой, локализовано на внутренней стороне ЦПМ и происходит следующим образом:

NO₂ ^– + H₂O = NO₃ ^– + 2H⁺ + 2е^–.

Электроны поступают на цитохром a₁ и через цитохром c на терминальную оксидазу aa₃ где акцептируются молекулярным кислородом. При этом происходит перенос через мембрану 2H⁺. Поток электронов от NO₂^– на O₂ происходит с участием очень короткого отрезка дыхательной цепи

Многие хемоорганогетеротрофные бактерии, принадлежащие к родам Arthrobacter, Flavobacterium, Xanthomonas, Pseudomonas и др., способны окислять аммиак, гидроксиламин и другие восстановленные соединения азота до нитритов или нитратов. Процесс нитрификации этих организмов, однако, не приводит к получению ими энергии. Изучение природы этого процесса, получившего название гетеротрофной нитрификации, показало, что, возможно, он связан с разрушением образуемой бактериальными культурами перекиси водорода с помощью пероксидазы. Образующийся при этом активный кислород окисляет NH₃ до NO₂^–.

Нитрифицирующие бактерии обнаружены в водоемах разного типа и в почвах, где они, как правило, развиваются совместно с бактериями, жизнедеятельность которых приводит к образованию исходного субстрата нитрификации — аммиака.

Процесс нитрификации, являясь важным звеном в круговороте азота в природе, имеет как положительные, так и отрицательные стороны. Переведение азота из аммонийной формы в нитратную способствует обеднению почвы азотом, поскольку нитраты легко вымываются из почвы. В то же время нитраты — хорошо используемый растениями источник азота. Связанное с нитрификацией подкисление почвы улучшает растворимость и, следовательно, доступность некоторых жизненно необходимых элементов, в первую очередь фосфора и железа.

Аммонифицирующие бактерии

Аминокислоты и белки также могут выступать в качестве энергетических ресурсов для эубактерий. Их использование связано в первую очередь с определенными ферментативными преобразованиями подготовительного характера. Белки сначала вне клетки расщепляются протеолитическими ферментами, катализирующими разрыв определенных пептидных связей, на отдельные фрагменты — пептиды, которые затем поглощаются клеткой и расщепляются внутриклеточными протеолитическими ферментами до отдельных аминокислот. Дальнейшее их превращение возможно по нескольким направлениям: 1) аминокислоты непосредственно используются в конструктивном метаболизме для построения белковых молекул; 2) аминокислоты служат основным материалом в энергетических процессах. В последнем случае метаболизирование аминокислот начинается с их декарбоксилирования или дезаминирования.

В результате декарбоксилирования аминокислот образуется CO₂ и первичные амины:

R-CHNH₂-COOH = R-CH₂NH₂ + CO₂.

Наиболее известны из них путресцин и кадаверин, возникающие в результате декарбоксилирования орнитина и лизина при анаэробном разложении белка.

Дезаминирование — отщепление аминогруппы от аминокислоты, приводящее к выделению азота в виде аммиака, поэтому процесс распада белков, сопровождающийся образованием аммиака, получил название аммонификации. Судьба углеродного скелета аминокислоты при дезаминировании различна. Процесс может происходить при участии молекулярного кислорода:

R-CHNH₂-COOH + 1/2O₂ = R-CO-COOH + NH₃; (1)

с помощью НАД-зависимых дегидрогеназ:

R-CHNH₂-COOH + НАД⁺ + H₂O = R-CO-COOH + НАД-H₂ + NH₃, (2)

или в форме гидролиза:

H₂N-CO-NH₂ + H₂O= 2NH₃ + CO₂. (3)

Дезаминирование, при котором происходят окислительные (примеры 1, 2) или гидролитические (пример 3) преобразования углеродного скелета аминокислот, получило название окислительного или гидролитического дезаминирования соответственно.

При дезаминировании некоторых аминокислот (аланина, аспарагиновой, глутаминовой кислот) образуются a-кетокислоты (пировиноградная, a-кетоглутаровая, щавелевоуксусная), принадлежащие к числу промежуточных продуктов клеточного катаболизма. Большинство же возникающих при этом органических кислот подвергается сначала предварительным превращениям, приводящим к появлению соединений, способных прямо включаться в основные катаболические пути клетки. Например, распад L-лейцина в конечном итоге приводит к образованию ацетил-КоА — исходного субстрата ЦТК. Такова энергетическая сторона метаболизма бактерий-аммонификаторов.

Использование в качестве источника углерода и энергии аминокислот требует от организмов соответствующего набора ферментов, катализирующих протеолиз белков и пептидов и дезаминирование всего набора аминокислот. Для аммонификаторов вообще характерно использование широкого круга органических соединений, в том числе сахаров, органических кислот, которые, как правило, они предпочитают белкам. Форм, приспособленных к использованию только белков, немного.

Эта группа представлена в основном грамположительными споровыми палочками, входящими в состав рода Bacillus (В. subtilis, В. megatherium). Из бесспоровых форм в группу аммонификаторов входят представители родов Pseudomonas, Micrococcus, Arthrobacter, Mycobacterium, Proteus.

Процесс аммонификации в быту известен как "гниение", поскольку при этом происходит накопление продуктов, обладающих неприятным специфическим запахом: сероводорода, метилмеркаптана, первичных аминов, известных под названием "трупных ядов". Роль гнилостных бактерий в природе огромна. Доля белка в тканях умерших животных и растений велика, и аммонификаторы осуществляют минерализацию белков, разлагая их в конечном итоге до CO₂, NH₃ и H₂S.

Денитрифицирующие бактерии

У многих эубактерии конечным акцептором электронов дыхательной цепи, наиболее часто заменяющим молекулярный кислород, служит нитрат. Он может восстанавливаться до нитрита, накапливающегося в среде, или молекулярного азота, удаляющегося в атмосферу. Процесс восстановления нитрата до нитрита в системе энергетического метаболизма, получивший название нитратного дыхания, широко распространен среди эубактерии и обнаружен у представителей более 70 родов.

Гораздо уже круг организмов, способных восстанавливать нитраты или нитриты до N₂. H₂ этом пути в качестве промежуточных продуктов идентифицированы окись (NO) и закись (N₂O) азота:

NO₃^– → NO₂^–   → NO →  N₂O   → N₂.

Как и молекулярный азот, NO и N₂O — газообразные продукты.

Процесс восстановления NO₃ ^– или N₂O до какой-либо из газообразных форм азота получил название денитрификации. К денитрификации способны только прокариоты. Значение процесса — генерирование АТФ в анаэробных условиях, используя для акцептирования электронов, поступающих в дыхательную цепь, восстановление NO₃ ^– или NO₂ ^– . Наиболее распространенные формы денитрификации — восстановление NO₃ ^– или NO₂ ^– до N₂. Встречаются также штаммы, осуществляющие отдельные этапы процесса: NO₃ ^–   →N₂O, N₂O или NO  → N₂. "Полная" или "усеченная" денитрификация обнаружена у эубактерии, принадлежащих ко всем основным физиологическим группам: фототрофам и хемолитотрофам, грамположительным и грамотрицательным факультативным анаэробам. В наибольшей степени способность к денитрификации распространена у бактерий из родов Bacillus и Pseudomonas.

Свойство восстанавливать нитрат представляется менее необычным, если вспомнить, что бактерии, использующие в качестве источника азота нитраты (а таких много), должны иметь ферментную систему для его восстановления, так как в конструктивном метаболизме азот участвует только в восстановленной форме. Таким образом, восстановление нитрата в системе реакций конструктивного метаболизма, получившее название ассимиляционной нитратредукции (NO₃^– → NH₃), очевидно. Оно имеет место всегда при выращивании на среде с нитратами в качестве единственного источника азота.

Способность к ассимиляционной нитратредукции необязательно облигатно связана со способностью к денитрификации. Например, Pseudomonas aeruginosaобладает обеими метаболическими активностями; у Rhodopseudomonas sphaeroides обнаружена способность к денитрификации, но не к ассимиляции нитрата; наконец, многие эубактерии могут ассимилировать нитрат, но не могут осуществлять денитрификацию. Оба процесса восстановления нитрата различаются по ряду. Информация об ассимиляционной нитратредукции и денитрификации закодирована в разных генах.

Таблица 32. Различия между ассимиляционной нитратредукцией и денитрификацией

Признак	Ассимиляционная нитратредукция	Денитрификация
Локализация в клетке	в цитоплазме	в мембранах
Отношение к энергетическому метаболизму	не связана с получением клеточной энергии	связана с синтезом АТФ
Отношение к O2	нечувствительна к O2	O2 ингибирует активность и репрессирует синтез NO2–- и NO3–-редуктаз
Отношение к NH3	репрессирует синтез ферментов
Судьба конечного продукта	входит в состав азотсодержащих клеточных компонентов	выделяется из клетки

Большинство денитрификаторов — хемоорганотрофы. Использование в качестве конечного акцептора электронов нитратов позволяет им окислять органические субстраты полностью (до CO₂ и H₂O) по обычным катаболическим путям. Переходящий на переносчики водород поступает в дыхательную цепь.

Изменение свободной энергии при окислении 1 молекулы глюкозы молекулярным кислородом (DG₀' = – 2870 кДж/моль) того же порядка, что и окисление этого же субстрата в анаэробных условиях нитратом, восстанавливающимся до нитрита (DG₀' = — 1770 кДж/моль) или молекулярного азота (DG₀' = — 2700 кДж/моль). Таким образом, энергетические возможности процесса окисления глюкозы с участием нитрата сопоставимы с энергетическими возможностями процесса аэробного дыхания. Запасание клеткой полезной энергии при денитрификации зависит от организации электронного транспорта, свойств и локализации соответствующих редуктаз. Электронтранспортные цепи денитрификаторов в анаэробных условиях содержат все основные типы связанных с мембранами переносчиков: флавопротеины, хиноны (убихинон, менахинон или нафтохинон), цитохромы типа b, c. Цитохромоксидазы в этих условиях не синтезируются.

Полный процесс денитрификации состоит из 4 восстановительных этапов, каждый из которых катализируется специфической мембрансвязанной редуктазой. Нитратредуктазы всех денитрификаторов структурно сходны между собой (содержат Мо-FeS-белки) и катализируют восстановление нитрата до нитрита в соответствии с уравнением:

NO₃^– + 2e ^– + 2H⁺ = NO₂^– + H₂O.

С дыхательной цепью нитратредуктазы сопряжены на уровне цитохрома b.

Нитритредуктазы (1) и, вероятно, редуктазы окиси (2) и закиси (3) азота акцептируют электроны на уровне цитохрома с, осуществляя следующие реакции:

NO₂ ^– + e^– + H⁺ = NO + OH^–; (1)

2NO + 2e ^– + 2H⁺ = N₂O + H₂O; (2)

N₂O + 2e^– + 2H⁺ = N₂ + H₂O. (3)

В дыхательной цепи денитрификаторов при переносе электронов на нитрат функционируют 2 генератора Dm_H⁺ (вместо 3 при переносе электронов на O₂). Процесс восстановления нитрата до нитрита локализован на внутренней стороне ЦПМ. По другим данным, ферментный комплекс имеет трансмембранную ориентацию в результате чего поглощенные из цитоплазмы протоны переносятся на противоположную сторону, где участвуют в нитратредуктазной реакции. В любом из вариантов это приводит к созданию трансмембранного протонного градиента нужного направления. Таким образом, при денитрификации перенос 2 электронов сопряжен с трансмембранным переносом 4 протонов, т. е. энергетический выход составляет примерно 70% сравнительно с аэробным дыханием.

Все денитрифицирующие бактерии — факультативные анаэробы, переключающиеся на денитрификацию только в отсутствие O₂, поэтому, вероятно, их приспособление к анаэробным условиям — вторичного происхождения. Способность к денитрификации развилась после сформирования механизмов использования О₂ как конечного акцептора электронов. Первым шагом на пути вторичного приспособления к анаэробным условиям явилось развитие нитратного дыхания. Следующий шаг — совершенствование способности использовать нитраты для акцептирования электронов дыхательной цепи — привел к возникновению денитрификации.

Денитрифицирующие бактерии — обитатели пресных и морских водоемов, почв разного типа, в связи с чем денитрификация широко распространена в природе. Этот процесс служит источником атмосферного азота, являясь необходимым звеном в круговороте азота в природе. В то же время денитрификация имеет отрицательное значение, так как приводит к обеднению почв азотом. Потери азотных удобрений в почвах в результате денитрификации могут составлять от 5 до 80%. Один из способов борьбы с денитрификацией — рыхление почвы, создающее в ней аэробные условия, что заставляет денитрифицирующие бактерии перестраивать электронтранспортные системы, осуществляя перенос электронов на O₂, а не на нитраты.

Азотфиксация — способность микроорганизмов восстанавливать стабильную молекулу азота до аммиака — служит основным источником биодоступного азота для всех обитателей нашей планеты.

Азотфиксация в природе осуществляется как свободноживущими микроорганизмами (несимбиотйческая азотфиксацин), так и бактериями, существующими в сообществе с растениями (симбиотическая азотфиксация).

Несимбиотическая (свободная)азотфиксация осуществляется бактериями рода Azotobacter, фиксирующими около 20 мг азота на 1 г использованного сахара, аноксигенными фототрофными бактериями, цианобактериями, клостриднями, факультативными анаэробами Bacillus polymixa, Klebsiella pneumoniae, хемолитотрофными бактериями Alcaligenes latus, Xanthobacter autotrophicus, метилотрофными, метаногенными и сульфатредуцирующими бактериями).

Симбиотическая фиксация азота осуществляется бактериями рода Rhizobium (вызывают образование клубеньков у бобовых растений), актиномицетами рода Franckia (симбионты тропических растений), цианобактериями Anabaena azollae, Nostoc punctiforme.

Фермент, необходимый для азотфиксации – нитрогеназа: 2 комплекса Мо и Fe-белок(200кД*4), FeS-белок (80кД*2). Фермент чувствителен к кислороду.

N₂ +2е= NH-NH +2е= H₂N-NH₂ +2е= 2 NH₃

Для восстановления 1 молекулы азота необходимы 12АТФ.

Нитрогеназа не является специфичной:

N₂ (нитрогеназа)= NH₄

2Н⁺=Н₂

С₂Н₂ +2Н⁺= С₂ H₄

Гены, кодирующие нитрогеназу, относятся к генам nif.

Симбиотическая фиксация азота на примере рода Rhizobium.

1. Узнавание бактерией корневого волоска данного растения с помощью рецепторов, к-ые чувствительны к лектинам растения (гликопротеины), Образование комплекса путем специфического взаимодействия.

2. Бактериальная клетка начинает расти тонкой нитью в сторону корневого волоска (инфекционная нить). Растет исключ-но по тетраплоидным клеткам раст., гаплоидные не затрагивает.

3. Выделение ростового стимулятора раст. – раст.клетка увеличивается в размерах, интенсивно делится. В результате обр-ся клубеньки.

4. На разрезе клубенька – особые образования, окруженные мембраной. Одиночные клетки или в группах содержат красный пигмент – леггемоглобин (содержит железо II) – это клетки бактероиды. Леггемоглобин чувствителен к O₂ (при воздействии кислорода он разрушается и превращается в желто-зеленый пигмент биливердин). С синтеза леггемоглобина и начинается азотфиксация.

5. [8Н] + N₂+2H⁺ = 2NH₄⁺ + H₂ (требуются восстановит.эквиваленты и 12 АТФ).