27. Нитратное дыхание. Микроорганизмы, ведущие диссимиляционную нитратредукцию. Механизмы реакций и ферменты процесса нитратного дыхания. Условия процесса. Энергетические возможности процесса.

Микроорганизмы используют нитрат для двух целей. Во-первых, подобно большинству растений, многие бактерии способны извлекать из него азот для синтеза азотсодержащих клеточных компонентов. Такая ассимиляционная нитратредукция может протекать и в аэробных, и в анаэробных условиях. Во-вторых, возможна также диссимиляционная нитратредукция, или «нитратное дыхание»; при этом нитрат в анаэробных условиях служит конечным акцептором водорода. В обоих случаях нитрат сначала восстанавливается до нитрита с помощью молибденсодержащего фермента нитратредуктазы.

Нитратное дыхание: денитрификация. Денитрифицирующие бактерии (Bacillus licheniformis) обладают способностью восстанавливать нитрат через нитрит до газообразной закиси азота (N₂0) и азота (N₂):

NO3->NO2->NO->N2O->N2.

10[Н]   +   2Н⁺   +   2N0₃^_   -» N₂   +   6Н₂0

В отсутствие кислорода нитрат, таким образом, служит конечным акцептором водорода.

 Способность получать энергию путем использования нитрата как конечного акцептора водорода с образованием молекулярного азота широко распространена у бактерий. Этот процесс денитрификации до сих пор был обнаружен только у факультативных аэробов; по-видимому, среди облигатных анаэробов нет денитрифицирующих форм. Кроме того, бактерии чаще обладают полной дыхательной системой; синтез ферментов, необходимых для денитрификации (мембраносвязанные нитратредуктаза А и нитритредуктаза), индуцируется только в анаэробных условиях. У многих денитрификаторов эта индукция происходит лишь в присутствии нитрата, хотя для некоторых достаточно создания анаэробных условий. Многие денитрификаторы могут расти, используя в качестве акцептора водорода не только нитрат, но и нитрит, а иногда даже закись азота. Из этого следует, что не только нитратредуктаза А, но и диссимиляционная нитритредуктаза связана у них с дыхательной цепью и участвует в выработке энергии.

Поскольку некоторые денитрификаторы используют нитрат исключительно или преимущественно как акцептор водорода, но не могут восстанавливать его до NH4, необходимо добавлять в среду источник азота (пептон или соль аммония).

Особенности регуляции нитратредуцирующей ферментной системы у бактерий: эти ферменты индуцируются нитратом только в анаэробных условиях. молекулярный кислород подавляет (репрессирует) синтез нитрат- и нитритредуктаз. В том случае, если ферменты уже были синтезированы до того, как клетки пришли в соприкосновение с кислородом воздуха, кислород вступает в конкуренцию с нитратом за электроны, поступающие из дыхательной цепи, а также подавляет функцию нитратредуцирующей системы.

Значение денитрификации в природе. Денитрификация - единственный биологический процесс, благодаря которому связанный азот преобразуется в свободный N₂. С глобальной точки зрения этот процесс имеет решающее значение для сохранения жизни на земной суше. В нормально аэрируемых почвах и водоемах нитрат представляет собой конечный продукт минерализации. Благодаря своей высокой растворимости в во­де и слабому связыванию почвой нитрат-ионы вымывались бы из почвы и накапливались в морской воде; содержание молекулярного азота в атмосфере стало бы уменьшаться, и процессы роста растений и про­дукции биомассы на суше в конце концов прекратились бы.

Нитратное дыхание: восстановление нитрата до нитрита. Для целого ряда факультативно-анаэробных бактерий (Enterobacter, Escherichia coli и др.) нитрат может служить конечным акцептором водорода в процессе транспорта электронов, поставляющем энергию. Этот вид «нитратного дыхания» отличается от денитрификации тем, что здесь только первая ступень, а именно восстановление нитрата до нитрита с по­мощью нитратредуктазы А, сопряжена с переносом электронов и преобразованием энергии:

При этом нитрит может накапливаться в культуральной жидкости - образования N₂ не происходит.

Однако вместо этого нитрит может восстанавливаться до аммиака путем ассимиляционной нитритредукции с последующим выделением NH4 в среду. В таком случае говорят об аммонификации нитрата. Вос­становление нитрита до аммиака не позволяет клетке получать энергию. Речь идет скорее о процессе брожения, в котором нитрит играет роль экзогенного акцептора электронов. Таким образом, восстановле­ние нитрита все же дает известное преимущество: при сбраживании глюкозы часть атомов водорода расходуется на восстановление нитрита, в результате чего образуется больше ацетата.

28. Азотфиксация. Механизм процесса, реакции и ферменты. Нитрогеназа, ее строение и специфичность. Условия азотфиксации. Симбиотические и свободноживущие азотфиксаторы. Роль азотфиксации в сельском хозяйстве.

Азотфиксация — важнейший биологический процесс, играющий большую роль в круговороте азота в природе и обогащающий почву и водоёмы связанным азотом. В атмосфере содержится над 1 га почвы более 70 000 т свободного азота, и только в результате Азотфиксация часть этого азота становится доступной для использования высшими растениями. Свободноживущие азотфиксирующие бактерии связывают несколько десятков килограммов азота на 1 га в год. Сине-зелёные водоросли на рисовых полях фиксируют до 200 кг/га азота в год. Общая прибыль азота (в надземных органах и пожнивных остатках) при культивировании бобовых растений составляет от 57,5 до 335 кг/га в год. Количество азота, внесённого в почву бобовыми растениями за счёт деятельности клубеньковых бактерий, достигает 100 — 250 кг/га за сезон. Естественно, этот процесс имеет большое значение для улучшения почв и повышения урожайности с.-х. культур. С этой целью перед посевом семена бобовых смешивают с препаратами клубеньковых бактерий, делают бобовые предшественниками злаков в севообороте, сеют кукурузу с клевером, вику с овсом и пр.

Биохимия азотфиксации

Связывание N2-это восстановительный процесс, и первым его продук­том, который можно обнаружить, является аммиак. Процесс восстано­вления происходит на ферментном комплексе - нитрогеназе. Нитрогена-за состоит из двух компонентов: белка, в состав которого входят молибден, железо и сера, и белка, содержащего железо и серу1. Как сам фермент, так и процесс фиксации N2 отличаются крайней чувствитель­ностью к молекулярному кислороду. Это позволяет понять, почему как у свободноживущих азотфиксирующих бактерий, так и в ткани клубень­ков есть особые механизмы, защищающие нитрогеназу от высокого парциального давления кислорода.

Для связывания молекулярного азота необходимы восстановитель­ная сила и энергия (рис. 13.2), которые могут быть получены в процессе фотосинтеза, брожения или дыхания. В модельных экспериментах с очи­щенными компонентами нитрогеназной системы (in vitro) можно доста­влять энергию в виде АТР и восстановительную силу в форме восстано­вленных пиридиннуклеотидов и ферредоксинов, используя переносчики, содержащие флаводоксин. Затраты АТР при этом очень высоки.

Нитрогеназная система восстанавливает не только молекулярный азот (N=N), но и ацетилен (НС=СН), азид, закись азота, цианид, ни­триты, изонитрилы и протоны. На восстановлении ацетилена основан наиболее простой метод, позволяющий выявить нитрогеназу. Ацетилен восстанавливается только до этилена, который легко поддается количе­ственному определению с помощью газовой хроматографии. Все до сих пор исследованные азотфиксирующие микроорганизмы и симбиотиче-ские системы способны восстанавливать ацетилен.

Если нет молекулярного азота, нитрогеназная система восстанавливает протоны до молекулярного водорода. Таким образом, нитрогеназная система обладает также свойствами АТР-зависимой Н2-образующей гидрогеназы. По­скольку молекулярный водород образуется и в присутствии N2, можно вклю­чить соответствующую реакцию в уравнение, описывающее фиксацию азота:

8[Н] + N2 + 2Н+ - 2NH4+ + Н2

Большинство азотфиксирующих бактерий содержит наряду с нитрогеназой и (классическую) гидрогеназу. активирующую Н2. Функция этой гидрогеназы за­ключается, по-видимому, в использовании водорода, образующегося при фикса­ции молекулярного азота.

Регуляция связывания азота. У многих бактерий нитрогеназа обра­зуется только тогда, когда она необходима, т. е. в отсутствие подходя­щего источника связанного азота. Ионы аммония подавляют синтез ни-трогеназы. У пурпурных и зеленых бактерий под влиянием этих ионов уменьшается также активность уже синтезированного фермента. В регу­ляции образования нитрогеназы большую роль, очевидно, играет глу-таминсинтетаза. Глутаминсинтетаза и глутаматсинтаза нужны бакте­риям для включения ионов аммония в органические соединения в том случае, если эти ионы присутствуют лишь в низкой концентрации. Эта система обладает высоким сродством к ионам аммония и поддерживает их концентрацию в клетке на низком уровне. Повышение концентрации ионов аммония в окружении клетки (а тем самым и внутри клетки) по­давляет образование глутаминсинтетазы, а в результате-и нитроге­назы.

Фиксация азота свободноживущими бактериями

До 1949 г. способность к фиксации молекулярного азота рассматрива­лась как свойство, присущее лишь немногим бактериям, относящимся в основном к родам Clostridium и Azotobacter. Положение изменилось, когда начали применять метод изотопных индикаторов (15N2), а также реакцию с восстановлением ацетилена, выявляющую нитрогеназу-фер­ментный комплекс, связывающий N2; тогда выяснилось, что такой спо­собностью обладают и многие другие бактерии, в том числе большин­ство аноксигенных фототрофных бактерий, многие цианобактерии, факультативные анаэробы (Klebsiella pneumoniae, Bacillus polymyxa), xe-молитоавтотрофные бактерии (Xanthobacter autotrophicus, Alcaligenes latus), метилотрофные, сульфатредуцирующие и метанобразующие бак­терии.

Особенно эффективно связывают азот виды Azotobacter (около 20 мг азота на 1 г использованного сахара). Различают несколько видов Azotobacter, распространенных в разных местообитаниях (табл. 13.1). Все они грам-отрицательные, относительно крупные, в определенных усло­виях передвигаются с помощью жгутиков; все-строгие аэробы, спо­собные окислять многие органические соединения. У A. chroococcum клетки соединены попарно. Обильное образование слизи и наличие темных пигментов (меланинов) придают колониям характерный вид. При недостатке питательных веществ образуются цисты с толстыми клеточными стенками («артроспоры», «микроцисты»).

Азотфиксирующие бактерии были найдены в области корневой си­стемы многих культурных растений; Azotobacter paspali растет на по­верхности корней Paspalum notatum, а в ризосфере Digitaria decumbens об­наружена бактерия Azospirillum lipoferum.

Фиксация азота свободноживущими цианобактериями имеет суще­ственное значение, во всяком случае на рисовых полях (где они связы­вают 30-50 кг азота на 1 га в год). В чистых культурах способность связывать азот установлена примерно у 40 видов цианобактерии. Эти организмы одни из первых заселяют бедные (например, вулканические) почвы. Их можно встретить в самых экстремальных местообитаниях-и в Антарктиде при температурах, близких к точке замерзания, и в горя­чих источниках. Живут они либо изолированно, либо в симбиозе с гри­бами (лишайники). Во внутренних водоемах и в некоторых областях океана ежегодно наблюдается массовое развитие цианобактерий, так называемое «цветение воды». Пока еще не выяснено, в какой мере циа­нобактерий участвуют в накоплении азота и продукции биомассы в морях.

Микроэлементы, необходимые для фиксации азота. Для фиксации мо­лекулярного азота необходим молибден (табл. 13.2). Этот тяжелый ме­талл входит в состав нитрогеназы.

Для связывания N2 бобовыми растениями необходим, кроме того, кобальт. Он содержится в коферменте В12, который действует как кофактор ферментов метилмалонил-СоА-мутазы и нуклеотидредуктазы.

Фиксация азота симбиотическими бактериями

В связи с заметным обогащением почвы связанным азотом его симбио-тическая фиксация давно обратила на себя внимание при разных агро­технических приемах (пар, севооборот), и ее стали сознательно исполь­зовать в сельском хозяйстве.

На то, что клевер и другие бобовые растения обогащают почву азотом, впервые указал Буссенго. Установление связи между фиксацией азота и кор­невыми клубеньками бобовых явилось заслугой Хелльригеля и Вильфарта (1886-1888). Бобовые могут расти в отстутствие связанного азота лишь в том случае, если их корни усеяны клубеньками, которые образуются в результате за­ражения корневых волосков бактериями из почвы (рис. 13.1).

Корневые клубеньки бобовых растений. Бактерии, вызывающие обра­зование клубеньков у бобовых растений (клубеньковые бактерии), отно­сятся к роду Rhizobium. При свободном существовании в почве эти аэ­робные грам-отрицательные палочки растут как сапрофиты за счет органических соединений. По специфичности в отношении растения-хо­зяина, а также по некоторым другим признакам различают несколько видов клубеньковых бактерий (Rhizobium leguminosarum, R. meliloti, R. trifolii, R. phaseoli, R. lupini, R. japonicum и др.).

Заражение растения происходит только через молодые корневые во­лоски (рис. 13.1). Бактерии внедряются на самом конце или около конца волоска и растут в форме инфекционной нити до его основания. Затем такие нити, одетые целлюлозной оболочкой, проникают сквозь тонкие стенки молодых клеток эпидермиса в кору корня. Натолкнувшись здесь на одну из тетраплоидных клеток коры, нить стимулирует деление как самой этой клетки, так и соседних диплоидных клеток. Инфекционные нити разветвляются и распределяются по тетраплоидным клеткам. В результате такого разрастания тканей, вызванного Rhizobium при уча­стии ростового вещества, происходит образование клубеньков. Бакте­рии в клубеньках размножаются очень быстро и образуют крупные клетки неправильной формы (бактероиды), объем которых может в 10-12 раз превышать объем свободноживущих Rhizobium; бактероиды располагаются по отдельности или группами, окруженные мембраной, в цитоплазме растительных клеток. Ткань, заполненная бактериями, имеет красноватую окраску-она содержит пигмент леггемоглобин, род­ственный гемоглобину. Молекулярный азот фиксируют только те клу­беньки, в которых имеется леггемоглобин; «пустые», не содержащие пигмента клубеньки к фиксации азота не способны. Появление пигмента в ткани совпадает по времени с началом фиксации N2. При разрушении леггемоглобина с образованием зеленых желчных пигментов (биливер-динов) прекращается и связывание азота. Леггемоглобин, по всей ве­роятности, находится в цитоплазме растительной клетки, а не в про­странствах между бактероидами и окружающими их мембранами. Образование пигмента-это специфический результат симбиоза: просте-тическая группа (протогем) синтезируется бактероидами, а белковый компонент-при участии растения. Леггемоглобин сходен с миоглоби-ном, в клубеньках он представлен в основном Ре(П)-содержащей фор­мой. Этот пигмент обладает высоким сродством к кислороду. Можно предполагать, что леггемоглобин облегчает диффузию кислорода через клетку растения к бактероиду. Благодаря особым свойствам леггемо­глобина бактероиды снабжаются кислородом в количестве, достаточ­ном для их роста и для получения энергии, и в то же время не создается слишком высокого парциального давления 02, неблагоприятного для фиксации азота бактероидами.

29

НИТРИФИКАЦИЯ В ПОЧВАХ

В 1890-1892 гг. С.Н. Виноградский, используя строго минеральные среды, впервые выделил чистые

культуры нитрифицирующих бактерий и, более того, показал, что существуют две

группы нитрификаторов - одна активно окисляет аммоний до нитрита,

другая - нитрит до нитрата, и доказал, что нитрифицирующие бактерии

являются хемолитоавтотрофами, получающими энергию для биосинтетических

целей при окислении аммония и нитрита, а в качестве источника углерода

использующими С02. Значительно позднее установлено, что многие

гетеротрофные микроорганизмы, в том числе и грибы, могут тоже продуцировать

нитрит и нитрат, окисляя аммоний и иные восстановленные органические и

неорганические соединения азота.

Таким образом, в настоящее время нитрификация определяется как

биологический процесс окисления аммония узкоспециализированными хе-

молитоавтотрофными бактериями в нитриты и затем в нитраты, а в случае

гетеротрофных микроорганизмов - и разнообразных органических

азотсодержащих соединений. Деятельность нитрифицирующих

микроорганизмов является главным источником нитратов в почве и биосфере.

Исключение составляют несколько химических реакций образования нитратов из

оксидов азота в атмосфере, не играющих заметной роли в природе.

Микробная трансформация азотсодержащих соединений в нитраты прямо

влияет на интенсивность других процессов цикла азота. С одной стороны,

повышенные концентрации нитратов в почвах усиливают денитрификацию и

минерализацию органических веществ, а с другой - снижают поступление

азота в почву за счет азотфиксации и эффективность его микробной

иммобилизации.

Сложность ситуации состоит в том, что, хотя нитраты - основной

источник азотного питания сельскохозяйственных растений, при интенсивных

системах земледелия возникают условия их избыточного образования в

почве, что приводит к серьезным экологическим и медико-биологическим

последствиям. Для предупреждения заболеваний, связанных с нитратами,

актуальным остается изучение причин их аккумуляции в почвах, воде,

растениях, выявление путей поступления в организм человека и животных,

разработка нормативов ПДК для компонентов окружающей среды и

сельскохозяйственной продукции.

Решение этой комплексной проблемы может быть найдено в ходе

углубленного изучения эколого-физиологических особенностей микроорганизмов-

нитрификаторов и определения влияния природных и антропогенных

факторов на активность нитрификации в почвах, что позволит более успешно вести

поиск приемов землепользования, не допускающих накопления нитратов в

почвах и растениях в опасных для человека и биосферы концентрациях.

Автотрофные нитрифицирующие бактерии

Процесс автотрофной нитрификации осуществляется аммоний- и нитри-

токисляющими бактериями и описывается следующими уравнениями:

NH+ + 1,502 -> N02(N20) + Н20 + 2Н+, AGo - -272 кДж/моль,

N02 + 0,5О2 -> NO3, AGo - -73 кДж/моль.

Среди автотрофных нитрифицирующих бактерий встречаются штаммы,

которые лучше растут при парциальном давлении кислорода, более низком,

чем в воздухе, a Nitrobacterwinogradskyi и Nitrobacter hamburgensis -

факультативные анаэробы. Нитрифицирующие бактерии развиваются на средах в

диапазоне рН 5,8-9,0, с оптимум рН чаще всего 7,5-8,0. Температурный

оптимум - 25-30°С, лишь для некоторых штаммов - 38-40°С, а среди изолятов

Nitrosomonas europeus известны культуры, способные быстро расти при 4°С

Большинство нитрифицирующих бактерий - облигатные хемолитоавтот-

рофы, рост которых ингибируется органическими соединениями в

концентрациях, обычных для культивирования гетеротрофов. Вместе с тем опыты с

14С-меченными соединениями показали, что некоторые из них - Nitrosomonas

europea, Nitrosococcus осеапш, Nitrosolobus multiformis - могут использовать

формиат, ацетат, пируват, аланин, глутамат, глюкозу и ряд других

органических соединений. Однако углерод этих соединений включается только в

отдельные компоненты клеток и в меньшем количестве, чем из диоксида углерода, и, самое главное, они не обеспечивают энергетических потребностей

бактерий. Основным источником углерода у автотрофных нитрификаторов

является С02, ассимиляция которого осуществляется в восстановительном

пентозофосфатном цикле. Исключение составляют Nitrobacter vulgaris,

который хуже растет в хемолитоавтотрофных, чем в хемоорганогетеротрофных

условиях, и Nitrobacter hamburgensis, способный к росту в миксотрофных

условиях. При росте в миксотрофных условиях Nitrobacter winogradskyi и

Nitrobacter vulgaris сначала окисляют нитрит и только затем органические

соединения. У Nb. hamburgensis использование органических веществ и

нитрита идет одновременно. Способность некоторых видов нитробактеров

использовать органические соединения как источники энергии и углерода

определяется наличием у них всех ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК),

тогда как у облигатно автотрофных видов (например, Nitrosomonas europea и

Nitrosolobus multiformis) ЦТК функционировать не может из-за отсутствия

ключевого фермента - кетоглутаратдегидрогеназы.

В качестве источников азота нитрифицирующие бактерии используют

аммоний. Некоторые виды ассимилируют гидроксиламин, нитриты и

нитраты. Образование ассимиляторных нитрат-, нитритредуктазы известно у

Nitrobacter winogradskyi. Штаммы Nitrobacter xmnogradskyi и других видов

этого рода могут обладать способностью расти на средах с пептоном, гидролизатом казеина и дрожжевым экстрактом в качестве источников азота.

Nitrobacter europaea утилизирует в качестве источника азота гидроксиламин,

нитриты, но не нитраты. Представители Nitrosococcus sp. и Nitrosomonas sp:

могут проявлять уреазную активность.

Большинство данных относительно биохимического механизма первой

фазы нитрификации получено при изучении бактерии Nitrosomonas europaea.

Энергетическим субстратом у нее является аммиак и превращение его в

нитрит идет в ходе двух последовательных реакций:

NH3 + 02 + НАД • Н2 -> NH2OH + Н20 + НАД+,

NH2OH + 02 -> N02 (N20) +. Н20 + Н+.

Первая из этих реакций, приводящая к образованию гидроксиламина,

является эндергонической. Ключевой фермент хемолитоавтотрофного

окисления аммония - мембранно-связанная Cu-содержащая аммониймонооксиге-

наза, которая катализирует присоединение к молекуле аммиака 1 атома 02, а

второй взаимодействует, вероятно, с НАД • Н2, что приводит к образованию

Н26. Гидроксиламин высвобождается в периплазматическое пространство

бактериальной клетки и далее окисляется до нитрита (и до закиси азота) гид-

роксиламиноксидоредуктазой. Аммониймонооксигеназа, катализирующая

окисление аммиака, может участвовать в гидроксилировании и ряда других

субстратов, которые не обеспечивают рост нитрификаторов. К их числу

относятся монооксид углерода (СО), метан, некоторые неполярные органические

соединения - углеводороды и спирты. Многие из них являются

ингибиторами окисления аммония. С другой стороны, известно, что монооксигеназы ме-

танокисляющих бактерий катализируют окисление не только метана, но

также NH3 и ряда других соединений.

ПРОЦЕСС

Гидроксиламиноксидоредуктаза у Nitrosomonas europea локализована в пе-

риплазматическом пространстве. Это гемопротеин, который имеет молеку-

лярную массу 200 кД и состоит из (ХзРз~сУбъединиц. Помимо гемов с-типа в

него входит Р-460, также относящийся к гемовым соединениям. Окисление

гидроксиламина сопряжено с функционированием дыхательной электронт-

ранспортной цепи (ЭТЦ), в которую входят цитохромы с и а:

NH2OH -» цит. с-554 -> цит. с-552 -» цит. ах —> 02.

Электроны могут поступать в ЭТЦ при окислении HNO и NO до N02.

В ЭТЦ нитрифицирующих бактерий, окисляющих гидроксиламин, также

может входить убихинон - цитохром бс-комплекс.

Четыре электрона, высвобождающихся при окислении гидроксиламина,

участвуют в окислении аммиака в ЭТЦ и ассимиляции С02. Действие дыхательной

системы ведет к созданию разности трансмембранного электрохимического

потенциала и синтезу АТФ. Часть энергии, видимо, расходуется на

образование восстановленного НАД, необходимого для биосинтетических реакций.

Кроме того, окисление гидроксиламина, связанное с ЭТЦ, обеспечивает

функционирование монооксигеназы, которая катализирует превращение

NH3 в NH2OH, так как при этом происходит образование донора электрона,

взаимодействующего с указанным ферментом.

Вторую фазу процесса - окисление нитрита до нитрата, осуществляет

мембранно-связанный фермент нитритоксидоредуктаза, обнаруженный у

бактерий рода Nitrobacter [Кондратьева, 1996]. В ее состав входит молибдоп-

терин и железосодержащие кластеры. Превращение нитрита в нитрат

происходит при участии воды и связано с функционированием ЭТЦ, в которую

входят цитохромы a, q (с-550) и аа$.

N02 —» цит. а\ —> цит. q —> цит. аа3 —* Н20.

Окисление N02 до NO3 - процесс обратимый. Нитритоксидоредуктаза

присутствует у нитробактера не только при его росте в аэробных хемолитот-

рофных условиях и наличии N02, но и в клетках, выросших на органических

средах с NO3, а при низком р02 и без нитрата.

Итак, синтез АТФ у автотрофных нитрификаторов происходит в

результате окислительного фосфорилирования при переносе электронов с NH^h

N02 на 02 по дыхательной цепи, а источником углерода является С02

(растворенные в воде карбонаты).

Низкий окислительно-восстановительный потенциал пары NH4/NH2OH,

NH2OH/N02 и N02/N03 обусловливает функционирование короткой

электрон-транспортной цепи, и потому для приращения биомассы на 1 мг

бактерии p. Nitrosomonas окисляют 35 мг N-NH4, a p. Nitrobacter - до 100 мг N-N02.

Оптимальные концентрации аммония для энергетического метаболизма у

разных штаммов автотрофных нитрификаторов варьируют от 2,0 до 50,0 мМ,

нитрита - от 2,0 до 10 мМ. Максимальная скорость нитрификации и

концентрация конечных продуктов у автотрофных нитрификаторов достигает

соответственно, 1000—70 000 мг N/(r • сут) или и 2-4 мг N/мл среды. Важным

компонентом среды, который может существенно лимитировать активность

нитрификации в природе, является содержание фосфора. В чистой культуре

оптимальная концентрация фосфора для Nitrosomonas лежит в диапазоне

300-3000 мг/л, для Nitrobacter - 300-900 мг/л, и ее снижение ведет к

существенному увеличение лаг-периода.

Гетеротрофные нитрифицирующие микроорганизмы

В отличие от автотрофных нитрификаторов гетеротрофные

микроорганизмы способны окислять не только соли аммония, но и азот различных

органических соединений с образованием широкого спектра соединений - гид-

роксиламина (NH2OH), аминооксимов (R3NO), гидроксамовых кислот (R-

CONH2OH), нитрозосоединений (R2N-NO), нитросоединений (RCH2-N02),

нитритов и нитратов. Для гетеротрофов процесс не является энергодающим

и не связан непосредственно с клеточным ростом, вследствие чего

нитрифицирующая активность у них значительно ниже, чем у автотрофных

нитрифицирующих бактерий.

К настоящему времени предложено несколько биохимических

механизмов гетеротрофной нитрификации. Основное отличие между гетеротрофным

и автотрофным окислением аммония в гидроксиламин состоит в источнике

электронов для гидроксилирования: у гетеротрофов это органические

вещества, у автотрофов - сам гидроксиламин. Процесс гетеротрофного окисления

аммония рассматривают как результат действия бифункциональной

медьсодержащей ферментной системы, сходной по свойствам с аммониймоноокси-

геназой и тирозиназой. Проявление той или иной активности регулируется

активностью дыхательной цепи.

Гетеротрофные бактерии Paracoccus denitrificans, Thiosphaera pan-

toiropha (пересмотрены как Paracoccus denitrificans), Alcaligenes faecalis,

Pseudomonas putida обладают аммоний- и гидроксиламинокисляющими

ферментами, имеющими значительное сходство с ферментами автотрофных

нитрификаторов. Многие почвенные денитрифицирующие бактерии

являются гетеротрофными нитрификаторами.

Некоторые из них (Thiosphaera pantotropha) способны осуществлять

одновременно гетеротрофную нитрификацию и аэробную денитрификацию.

Поэтому их нитрификационный потенциал не может быть оценен исходя из

накопления нитратов и был определен на основе полного баланса азота.

Максимальная активность окисления аммония у Thiosphaera pantotropha составляла

93,9 нМ NH3 мин-1 • мг белка"1, что всего лишь на порядок ниже по сравнению

с автотрофными нитрификаторами [Robertson et al., 1988]. Предполагается,

что такая комбинация нитрификации и денитрификации используется для ре-

циклизации восстановленных эквивалентов (НАДН) в условиях недостатка

кислорода. За счет этого бактерия может поддерживать высокую скорость

роста и получить преимущество в условиях избыточного количества субстратов.

До настоящего времени не установлено, является ли окисление аммония

главной каталитической функцией аммониймонооксигеназаподобных

ферментов у гетеротрофных микроорганизмов, так как они могут окислять и

многие другие субстраты.

Метанокисляющие микроорганизмы, и особенно облигатные метанот-

рофные бактерии, также способны окислять аммоний до гидроксиламина и

далее до нитрита благодаря широкой субстратной специфичности метанмо-

нооксигеназы. Предполагается, что окисление аммония у многих других

гетеротрофов имеет сходный механизм.

КРАТКО!

Автотрофная нитрификация

Нитрификация проходит в две стадии, которые осуществляются разными микроорганизмами.