Лабораторна робота №2 тема: реакції осадження білків
МЕТА: Закріпити знання про білки як природні поліпептиди, їх будову, властивості. Вивчити реакції осадження білків методами висолювання, нагрівання, дії мінеральних і органічних кислот, солей важких металів, органічних розчинників (спирту, хлороформу, ацетону) тощо. З’ясувати механізм зворотного і незворотного осадження білків.
Теоретична частина
Розмір білкових молекул, розчинність білків, електричний заряд та інші фізико-хімічні властивості значною мірою свідчать про участь білків у процесах обміну речовин і функціях організму.
Стійкість білків як гідрофільних колоїдів залежить від наявності електричного заряду і водяної оболонки на поверхні білкових частинок.
При зниженні гідрофільності та втраті електричного заряду стійкість білків значно зменшується і вони випадають в осад. Реакції осадження використовують для виявлення білків, розділення білкових фракцій, добування безбілкових фільтратів у біохімічних дослідженнях.
Реакції осадження білків можна поділити на дві групи:
Оборотні реакції осадження, внаслідок яких структура білка не зазнає істотних змін, тому білок можна знову перевести в розчин із збереженням його початкових природних властивостей і біологічної активності. Так осаджують білки солі лужних і лужноземельних металів, органічні розчинники за низьких температур і нетривалої дії.
Необоротні реакції осадження або реакції денатурації, в результаті яких відбуваються необоротні зміни нативної структури, фізико-хімічних властивостей і біологічної активності білків. Необоротне осадження білків відбувається при дії високих температур, солей важких металів, концентрованих кислот, лугів, алкалоїдів та ін. Слід зазначити, що денатураційні зміни білка в деяких випадках мають оборотний характер.
Реакції коагуляції і денатурації білків можна вивчати під час осадження альбумінів або глобулінів сироватки крові або яєчного білка.
Альбуміни і глобуліни дуже поширені в органах і тканинах живих організмів. Вони належать до глобулярних білків і відрізняються між собою розчинністю. Характерною ознакою глобулінів є осадження дією слабкого розчину амоній сульфату (NH4)2SO4. Альбуміни добре розчиняються у воді і концентрованих розчинах солей, а осаджуються з насиченого розчину амоній сульфату (NH4)2SO4.
У водному розчині білкові молекули заряджені і гідратовані, що забезпечує стійкість білкових розчинів. При високій концентрації солей, йони яких теж гідратовані, відбувається руйнування водних оболонок білкових молекул у результаті конкуренції за воду йонів солей. Крім того, йони солей адсорбуються на поверхні білкової молекули, внаслідок чого зменшується заряд молекули білка, частинки білка менше відштовхуються, злипаються і випадають в осад.
Амоній сульфат має різко виражену висолюючу здатність і осаджує білки в нейтральному середовищі, а ще краще – у слабокислому. Інші солі, наприклад, натрій хлорид, осаджують білки лише при підкисленні розчину.
Для висолювання різних білків потрібна різна концентрація одних і тих же солей. Отже, білки можна висолювати фракційно. Так, глобуліни випадають в осад при напівнасичені розчину амоній сульфатом, а альбуміни осаджуються при повному насиченні.
Згортання білків при нагріванні відбувається залежно від умов проведення. Наприклад, розчин білка курячого яйця має кислу реакцію, гідратовані молекули білка мають від’ємний заряд, а рІ < 7,0. Якщо рН середовища більше значення ізоелектричної точки білка, то білкові молекули матимуть від'ємний заряд. Отже, лужне середовище буде перешкоджати досягненню кислим білком ізоелектричного стану (рН < 7,0), і білок не випадатиме в осад.
Сильнокисле середовище теж стримуватиме досягнення білком ізоелектричного стану, особливо для оснóвних білків, у яких рІ > 7,0.
Білки як амфотерні електроліти дисоціюють як кислоти і як основи. У водному середовищі, особливо поблизу ізоелектричної точки, молекули білка являють собою біполярні йони:
-OOC
– R
– NH
У кислому середовищі зменшується дисоціація білка по карбоксильних групах, молекула набуває позитивного заряду і знаходиться в розчині навіть при кип’ятінні.
У лужному середовищі зменшується протонізація аміногруп білка, молекула набуває негативного заряду і залишається навіть при кип’ятінні у розчині.
Додавання до розчину білка нейтральних солей полегшує і прискорює згортання білків при кип'ятінні внаслідок дегідратації. Згортання білків при нагріванні відбувається внаслідок їх денатурації – руйнування четвертинної, третинної, вторинної і первинної структури молекули – і є процесом практично незворотним.
Коли до концентрованих розчинів мінеральних кислот додавати розчин білка, то спочатку на межі двох рідин утворюється аморфний осад білка, який при струшуванні і перемішуванні розчиняється в надлишку хлоридної чи сульфатної кислоти.
Це розчинення у випадку з хлоридною кислотою пояснюється тим, що відбувається перезарядка білкової молекули і перехід з ізоелектричного стану (при рН < рІ) у стан з позитивним зарядом білкової молекули. У надлишку концентрованої сульфатної кислоти молекули білка руйнуються до найпростіших низькомолекулярних сполук, які не дають осаду.
У нітратній кислоті навпаки збільшується кількість осаду. Це відбувається внаслідок процесів нітрування ароматичних амінокислот білка і зшивання поліпептидних ланцюгів за рахунок продуктів реакції.
Органічні кислоти теж реагують з білками. Так, сульфосаліцилова та три хлороцтова кислоти є чутливими і специфічними реактивами на білок. Три хлороцтова кислота осаджує тільки білки і не осаджує продукти розпаду білків і амінокислот, тому нею користуються для повного вилучення білків з біологічних рідин.
Солі важких металів необоротно осаджують білки внаслідок зшивання поліпептидних ланцюгів багатовалентними атомами металів. Тому деякі білки використовують при отруєнні солями важких металів. Деякі з таких осадів (наприклад, із солями Купру му, Плюмбуму, Цинку) розчиняються в надлишку солі внаслідок адсорбції йонів цих металів на поверхні білкових частинок, в результаті чого білкові частинки набувають заряду і переходять у розчин.
При дії на розчин білка спирту випадає пластівчастий осад, що пояснюється дегідратацією білкових молекул.