5.2.7. Довготривале зберігання бактерійних та дріжджових трансформантів

Для довготривалого зберігання бактерійні трансформанти вирощують в пробірках (3 мл) селективного середовища при 37^оС упродовж ночі. Клітини осаджують центрифугуванням при 1000 с протягом 10-15 хв. 0,35 мл клітин вносять у епендорф з 0,1 мл 70 % стерильного холодного гліцерину, заморожують та зберігають при –70 ^оС. Дріжджові трансформанти вирощують в пробірках (3 мл) YPD середовища при 37^оС протягом ночі. Клітини осаджують центрифугуванням при 1000 об/хв протягом 10-15 хв. 0,25 мл клітин вносять у епендорф з 0,25 мл 70 % стерильного холодного гліцерину, заморожують та зберігають при –70^оС.

5.2.8. Виділення тотальної днк з клітин дріжджів

Реактиви: Поживне середовище (YPD)

50мМ ЕДТА (рН 8,0)

літиказа (50 мг/мл)

ізопропанол

70% етанол

РНКаза А

Фенол

96% етанол

5 М калій ацетат

3 М натрій ацетат

Розчин для лізису: 0,2% SDS

50 мМ ЕДТА (рН 8,0)

Хід роботи

Культуру клітин підрощували протягом ночі у поживному середовищі (3 мл) при температурі 28-30˚С. Культуру осаджували при 13000 g потягом 2 хвилин. Клітини ресуспендували в 293 мкл 50мМ ЕДТА та додавали 7 мкл літикази (концентрація 20 мг/мл) і перемішували. Клітини інкубували при 37˚С протягом години для руйнування клітинної стінки. Після цього клітини осаджували, додавали 300 мкл розчин для лізису ядер та інтенсивно піпетували. Епендорфи прогрівали при температурі 65˚С протягом 15 хвилин. Потім додавали 100 мкл 5 М калій ацетату для осадження білків. Білки відділяли центрифугуванням при 13000 g потягом 3 хвилин. До супернатанту додавали 0,7 об’єму ізопропанолу, центрифугували при 13000 g 2 хв, промивали в 500 мкл 76% етанолу, висушували, розчиняли в 100 мкл дистильованої води. Потім додавали рівний об’єм фенолу, перемішували, центрифугували при 14000 об/хв 10 хв. Верхню (водну) фазу відбирали, до неї додавали 1/10 об’єму 3 М натрій ацетату і 2,5 об’єми 96% етанолу. Інкубували при температурі -20°С 10-15 хв. Суміш центрифугували при 14000 об/хв 10 хв при температурі +4°С, осад ДНК промивали 76% етанолом. Розчиняли в дистильованій воді чи ТЕ буфері.

5.2.9. Лігування днк-вставки з днк-вектором.

Векторну молекулу ДНК змішують з фрагментом ДНК у співвідношенні 1:3 по концентрації пкмоль кінців вектора до кінців вставки. До суміші додають:

• 10 х буфер для лігування – 2 мкл

(витримують 5 хв. при 37⁰С, щоб звільнити „липкі” кінці)

• PEG 4000 – 4 мкл

• Т4 ДНК лігаза (Fermentas) – 8 од. акт./мкл загальної кількості ДНК

• Бідистильована вода – до 20 мкл

Суміш інкубують протягом 15 год. при 16^ºС. Лігазною сумішшю трансформують компетентні клітини Е. coli.

5.2.10. Елюція фрагментів днк з гелю.

Зважити 1.5 мл епендорф і записати його вагу. Використовуючи чистий скальпель, вирізати якомога менший фрагмент гелю, що містить потрібний зразок ДНК. Помістити вирізаний фрагмент в епендорф, зважити і обчислити вагу агарозного зрізу. Додати 10 мкл зв'язуючого буферу на кожні 10 мг агарозного фрагменту, інкубувати на водяній бані при 60⁰ С, перемішуючи, доки агароза повністю не розплавиться. Після цього перенести 600 мкл зв'язуючого буферу з пробою на колонку (GFX MicroSpin column), центрифугувати при 14000g 1 хв. Повторювати, доки вся проба не буде оброблена таким чином. Потім додати 500 мкл буферу для промивання, центрифугувати при тих же умовах. Додати 10-20 мкл буферу для елюції, інкубувати при кімнатній температурі 3-5 хв, центрифугувати при 14000g 2 хв.