5.2.5. Трансформація дріжджів з використанням літій ацетату і поліетиленгліколю

Реактиви:

1. LiAc/TE буфер (на 100 мл, стерилізується через фільтр для холодної стерилізації, зберігається при кімнатній температурі):

1,02 г – літій ацетат

1 мл – 1 М Tris-HCl pH 7,5

200 мкл – 0,5 М ЕДТА

2. Диметилсульфоксид (ДМСО)

3. 50% ПЕГ 3350 в LiAc/TE буфері (стерилізується через фільтр для холодної стерилізації, зберігається при кімнатній температурі)

Свіжу колонію дріжджів інокулювали в 3 мл рідкого середовища YPD та вирощували в умовах аерації (250 об/хв) при 30°С протягом ночі. Отриману „нічну” культуру (об’єм, достатній для отримання 0,2-0,3 од.опт.густ.) переносили в 100 мл рідкого середовища YPD та інкубували при 30°С, 250 об/хв. Протягом 3-5 годин до одержання 0,5-1,0 од.опт.густ. (довжина хвилі 600 нм; кювета 1,0 см). Клітини осаджували центрифугуванням при 3000 об/хв 10 хв, промивали в стерильному бідистиляті і ресуспендували в 25 мл LiAc/TE буферу. Клітини інкубували 1 год при 30°С, після чого осаджували центрифугуванням при 3000 об/хв 10 хв, ресуспендували в свіжому LiAc/TE буфері до кінцевої оптичної густини 100 од.опт.густ. (довжина хвилі 600 нм; кювета 1,0 см). Аліквоти по 50 мкл переносили в стерильні 1,5-мл епендорфи. Додавали плазмідну ДНК (1-10 мкг в 1-10 мкл ТЕ буферу або води) і 250 мкл 50% ПЕГ 3350 в LiAc/TE буфері, енергійно перемішували. Після інкубації при 30°С 30 хв додавали 35 мкл ДМСО на зразок та шокували клітини 15 хв при 42°С на водяній бані. Клітини охолоджували на льоду протягом 1 хв, після чого їх осаджували центрифугуванням при 4000 об/хв 30 с, промивали рідким середовищем YPD (3000 об/хв, 5 хв) та ресуспендували в 1 мл рідкого YPD, в якому інкубували клітини 1 год при 30°С. Після відживлення клітини осаджували центрифугуванням при 3000 об/хв 5 хв і двічі промивали в стерильному бідистиляті. Клітини ресуспендували в 150 мкл стерильного бідистиляту та висівали на селективне середовище.

5.2.6. Полімеразна ланцюгова реакція (плр)

ПЛР використовується для ампліфікації сегменту ДНК, який знаходиться між двома відомими послідовностями. Два олігонуклеотиди використовуються як праймери для серії синтетичних реакцій, що каталізуються ДНК-полімеразою. ПЛР здійснювали на ампліфікаторі Gene Amp^© PCR System 9700 (Applied Biosystems, США). Загальний об’єм реакційної суміші становив 50 мкл для препаративної ампліфікації фрагментів або 10 мкл для аналітичної реакції.

Склад реакційної суміші для препаративнї ПЛР: матриця – 0,1мкг, суміш dNTPs (Fermentas) – 5 мкл (100 мкмоль), буфер 10× - 5 мкл, відповідні праймери – по 5 мкл, Taq ДНК полімераза – 0,5 мкл (1 U, Fermentas), деіонізована вода - до об’єму 50 мкл.

Для аналітичної реакції: матриця – 0,01мкг, суміш dNTPs (Fermentas) – 1 мкл, буфер 10× - 1 мкл, відповідні праймери – по 1 мкл, Taq ДНК полімераза – 0,2 мкл, деіонізована вода - до об’єму 10 мкл.

Температуру плавлення (Т_m) визначали за формулою: Т_m = 4(G+C)+2(A+T), де G, T, C, A – кількість відповідних азотистих основ у праймері; Т_m становила 94⁰С. Температура приєднання праймерів (аннілінг) – визначалася специфічно для кожної пари праймерів.