5.2.2. Виділення плазмідної днк з клітин e.Coli

Даний метод є модифікацією швидкого лужного методу Бірнбойма і Долі.

Реактиви:

розчин І: 50 мМ глюкоза

25 мМ Tris-HCl (pH 8,0)

10 мМ ЕДТА

розчин ІІ: 0,2 М NaOH

1% SDS

ТЕ буфер: 10мМ Tris-HCl (pH 8,0)

1мМ ЕДТА

5 М калій ацетат, 3 М натрій ацетат, 7,5 М амоній ацетат, фенол, ізопропанол, 96% етанол

70% етанол.

Хід роботи

Плазмідовмісні клітини нарощували в 100 мл селективного середовища протягом ночі. Біомасу осаджували центрифугуванням при 4000 об/хв протягом 15 хв при 4ºС. Клітини ресуспендували в 2 мл розчину І , до суміші додавали 4 мл розчину ІІ, перемішували і додавали 3 мл 5 М калій ацетату. Центрифугували при 4000 об/хв протягом 15 хв, супернатант переносили в нову пробірку, додавали 0,7 об’єму ізопропанолу, залишали на 10 хв при кімнатній температурі. Проводили центрифугування при 5000 об/хв 15 хв для осадження ДНК. Осад промивали етиловим спиртом і висушували. Потім його розчиняли в 200 мкл води і додавали 10 мкл РНКази. Суміш інкубували 15 хв при температурі 37°С. Потім додавали 2 об’єми розчину амоній ацетату, струшували. Проводили центрифугування при 14000 об/хв 10 хв. Супернатант додавали у епендорфи до 0,7 об’єму ізопропанолу, центрифугували при 14000 об/хв 10 хв, промивали в 500 мкл 76% етанолу, висушували, розчиняли в 100 мкл дистильованої води. Потім додавали рівний об’єм фенолу, перемішували, центрифугували при 14000 об/хв 10 хв. Верхню (водну) фазу відбирали, до неї додавали 1/10 об’єму 3 М натрій ацетату і 2,5 об’єми 96% етанолу. Інкубували при температурі -20°С 10-15 хв. Суміш центрифугували при 14000 об/хв 10 хв при температурі +4°С, осад ДНК промивали 76% етанолом, після чого розчиняли його в дистильованій воді чи ТЕ буфері.

5.2.3. Електрофорез днк в агарозному гелі

Принцип методу полягає в здатності ДНК в електричному полі рухатись від катода до анода, що дозволяє розділяти та ідентифікувати різні фрагменти ДНК.

Реактиви:

0,8% агарозний гель

ТАЕ буфер: 0,04 М тріс-ацетат

0,002М ЕДТА

Буфер для нанесення проб

Бромистий етидій (концентрація 10 мг/мл)

Хід роботи

Агарозу (0,4 г) вносили в ТАЕ буфер (50 мл), нагрівали до повного розчинення і кип’ятили протягом 3 хв. Коли розчин охолодився до 50ºС, додавали бромистий етидій (4 мкл). Охолоджений розчин заливали у кювету з гребінцями для формування лунок. Після полімеризації гелю гребінці видаляли і кювету з гелем переносили в електрофоретичну камеру з ТАЕ буфером. В лунки вносили ДНК змішану з буфером для нанесення. Електрофорез проводили при напрузі 80-100В потягом 30 хв - 1 год. ДНК реєстрували, освітлюючи гель ультрафіолетовими променями. Електрофореграму фотографували.

5.2.4. Розщеплення днк ендонуклеазами рестрикції

Принцип методу ґрунтується на здатності ендонуклеаз рестрикції класу ІІ розщеплювати ДНК в певних сайтах.

В роботі використовували рестриктази та відповідні інкубаційні буфери виробництва фірми “Fermentas”.

Хід роботи.

Для реакції брали 1 мкг аналізованої ДНК, додавали 2 мкл відповідного буферу і 5-10 U ферменту. Об’єм суміші доводили до 20 мкл водою. Змішування проводилось на льоді при температурі близько 0ºС. Суміш інкубували протягом 1 год при температурі максимальної активності ферменту (30ºС або 37ºС). Реакцію зупиняли фенолом або нанесенням на колонки для подальшого очищення.