
- •Міністерство освіти і науки, молоді та спорту України
- •“Ефекту надекспресії гена fps1 на стійкость клітин дріжджів до ізобутилового спирту та інших спиртів”
- •1. Загальна інформація про організацію – базу проходження практики
- •2. Інформація про функції, структуру та організацію роботи біохімічної лабораторії, її забезпечення реактивами, матеріалами та обладнаннями
- •3. Опис виконання практики згідно з календарним планом
- •5. Матеріали і методи досліджень [6, 8]
- •5.1. Матеріали досліджень
- •5.2. Методи досліджень.
- •5.2.1. Електротрансформація e.Coli dh5α
- •5.2.2. Виділення плазмідної днк з клітин e.Coli
- •5.2.3. Електрофорез днк в агарозному гелі
- •5.2.4. Розщеплення днк ендонуклеазами рестрикції
- •5.2.5. Трансформація дріжджів з використанням літій ацетату і поліетиленгліколю
- •5.2.6. Полімеразна ланцюгова реакція (плр)
- •5.2.7. Довготривале зберігання бактерійних та дріжджових трансформантів
- •5.2.8. Виділення тотальної днк з клітин дріжджів
- •5.2.9. Лігування днк-вставки з днк-вектором.
- •5.2.10. Елюція фрагментів днк з гелю.
- •6. Результати та їх обговорення
- •7. Пропозиції кафедрі біохімії з покращення підготовки студентів як спеціалістів
- •Висновки
5. Матеріали і методи досліджень [6, 8]
5.1. Матеріали досліджень
У роботі були використані штами дріжджів Saccharomyces cerevisiae:
BY4742
(MAT
his3
1
leu2
0
met15
0
ura3
0);
рекомбінантні штами BY4742, трансформовані плазмідою pRS303K-ADH-FPS1-CYC.
В роботі використовували такі середовища:
YNB min, г/л:
YNB (Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and amonium sulfate) 1,7
(NH4)2SO4 5
Глюкоза 10 чи 20
урацил, гістидин, лізин, лейцин 40 мг
YPD, г/л:
Дріжджовий екстракт (YЕ) – 10;
Пептон – 10;
Сахароза або глюкоза –20;
Агар – 20.
Необхідні фактори росту додавали до мінімального середовища в концентрації 40 мг/л. Необхідний об’єм ізобутанолу та вітамінів додавали до мінімального середовища після стерилізації. Агаризовані середовища містили 1,5% агару.
Штам бактерій E. coli DH5α (φ80dlacZΔM15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rK-, mK+), supE44, relA1, deoR, Δ(lacZYA-argF)U169) було використано для одержання препаративних кількостей плазмід. Бактерії вирощували при 37оС на багатому середовищі LB (Лурія-Бертрані, 0.5% дріжджовий екстракт, 1% пептон, 1% NaCl)
Для селекції плазмідовмісних бактерій використовували ампіцилін у концентрації 100 мг/л. Селекцію дріжджових трансформантів здійснювали додаванням у середовище генетицину (G418) в концентрації 100-150 мкг/мл.
Клітини дріжджів та бактерій вирощували у пробірках об’ємом 20 мл, що містили 3 мл середовища, колбах об’ємом 500 мл, що містили 100 мл середовища на круговій качалці, та на чашках Петрі з 25 мл агаризованого середовища в термостаті при 370С для бактерій та 300С для дріжджів. Підрощували культури на круговій качалці (220 об/хв) при 370С (E. сoli) та 300С (S. cerevisiae). Кінетику росту дріжджових трансформантів досліджували, вирощуючи культури в колбах об’ємом 100 мл, що містили 30 мл середовища, на круговій качалці (220 об/хв) при 300С
Біомасу клітин (в одиницях оптичної густини (OD600) визначали за оптичним поглинанням розведених суспензій шляхом фотометрування на спектрофотометрі «Helios-λ» при довжині 600 нм у кюветі шириною 1 см.
5.2. Методи досліджень.
5.2.1. Електротрансформація e.Coli dh5α
Метод базується на здатності негативно зарядженої молекули ДНК рухатися в електричному полі від катода до анода, що дає можливість розділяти та ідентифікувати фрагменти ДНК.
Хід роботи
Свіжу колонію бактерійних клітин інокулювали в 2 мл рідкого середовища LB та вирощували в умовах аерації при 37ºС протягом ночі. Отриману „нічну” культуру розводили в 100 раз і підрощували у 100 мл багатого середовища до 0,5-1,0 од.опт.густ. (довжина хвилі 600 нм; кювета 1,0 см). Клітини осаджували центрифугуванням при 4000 об/хв 15 хв при 4ºС, промивали 3 рази в стерильному холодному бідистиляті і ресуспендували в 0,5 мл 10% гліцерину. До 40 мкл суспензії клітин додавали1-3 нг плазмідної ДНК (зразок); вносили суміш на дно 2 мл кювети; здійснювали електропорацію. Умови електропорації: опір – 129 Ом, ємність – 50 мкФ, напруга – 2,45кВ, тривалість імпульсу 4,5 мс. Після електропорації до кожного зразка додавали по 960 мкл рідкого середовища LB, інкубували 30-50 хв при 37ºС.