5. Матеріали і методи досліджень [6, 8]

5.1. Матеріали досліджень

У роботі були використані штами дріжджів Saccharomyces cerevisiae:

BY4742 (MAT his3 1 leu2 0 met15 0 ura3 0);

рекомбінантні штами BY4742, трансформовані плазмідою pRS303K-ADH-FPS1-CYC.

В роботі використовували такі середовища:

YNB min, г/л:

YNB (Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and amonium sulfate) 1,7

(NH₄)₂SO₄ 5

Глюкоза 10 чи 20

урацил, гістидин, лізин, лейцин 40 мг

YPD, г/л:

Дріжджовий екстракт (YЕ) – 10;

Пептон – 10;

Сахароза або глюкоза –20;

Агар – 20.

Необхідні фактори росту додавали до мінімального середовища в концентрації 40 мг/л. Необхідний об’єм ізобутанолу та вітамінів додавали до мінімального середовища після стерилізації. Агаризовані середовища містили 1,5% агару.

Штам бактерій E. coli DH5α (φ80dlacZΔM15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(r_K^-, m_K⁺), supE44, relA1, deoR, Δ(lacZYA-argF)U169) було використано для одержання препаративних кількостей плазмід. Бактерії вирощували при 37^оС на багатому середовищі LB (Лурія-Бертрані, 0.5% дріжджовий екстракт, 1% пептон, 1% NaCl)

Для селекції плазмідовмісних бактерій використовували ампіцилін у концентрації 100 мг/л. Селекцію дріжджових трансформантів здійснювали додаванням у середовище генетицину (G418) в концентрації 100-150 мкг/мл.

Клітини дріжджів та бактерій вирощували у пробірках об’ємом 20 мл, що містили 3 мл середовища, колбах об’ємом 500 мл, що містили 100 мл середовища на круговій качалці, та на чашках Петрі з 25 мл агаризованого середовища в термостаті при 37⁰С для бактерій та 30⁰С для дріжджів. Підрощували культури на круговій качалці (220 об/хв) при 37⁰С (E. сoli) та 30⁰С (S. cerevisiae). Кінетику росту дріжджових трансформантів досліджували, вирощуючи культури в колбах об’ємом 100 мл, що містили 30 мл середовища, на круговій качалці (220 об/хв) при 30⁰С

Біомасу клітин (в одиницях оптичної густини (OD₆₀₀) визначали за оптичним поглинанням розведених суспензій шляхом фотометрування на спектрофотометрі «Helios-λ» при довжині 600 нм у кюветі шириною 1 см.

5.2. Методи досліджень.

5.2.1. Електротрансформація e.Coli dh5α

Метод базується на здатності негативно зарядженої молекули ДНК рухатися в електричному полі від катода до анода, що дає можливість розділяти та ідентифікувати фрагменти ДНК.

Хід роботи

Свіжу колонію бактерійних клітин інокулювали в 2 мл рідкого середовища LB та вирощували в умовах аерації при 37ºС протягом ночі. Отриману „нічну” культуру розводили в 100 раз і підрощували у 100 мл багатого середовища до 0,5-1,0 од.опт.густ. (довжина хвилі 600 нм; кювета 1,0 см). Клітини осаджували центрифугуванням при 4000 об/хв 15 хв при 4ºС, промивали 3 рази в стерильному холодному бідистиляті і ресуспендували в 0,5 мл 10% гліцерину. До 40 мкл суспензії клітин додавали1-3 нг плазмідної ДНК (зразок); вносили суміш на дно 2 мл кювети; здійснювали електропорацію. Умови електропорації: опір – 129 Ом, ємність – 50 мкФ, напруга – 2,45кВ, тривалість імпульсу 4,5 мс. Після електропорації до кожного зразка додавали по 960 мкл рідкого середовища LB, інкубували 30-50 хв при 37ºС.