3. Опис виконання практики згідно з календарним планом

Практику проходили протягом шести тижнів. За цей час нами було виконано такий обсяг роботи:

• перший тиждень (17.09 – 21.09). Ознайомлення з правилами техніки безпеки, проходження інструктажу. Підготовка робочого місця, посуду, реактивів для проведення досліджень. Електротрансформація E.coli вектором pRS303K-ADH-FBP-CYC, виділення плазмідної ДНК. Клонування гену FPS1 за допомогою ПЛР. Обробка вектора та FPS1 ендонуклеазами рестрикції, лігування вектора і вставки, Електротрансформація E.coli.

• другий тиждень (24.09 – 28.09). Аналітична ПЛР з бактерійних колоній, виділення плазмідної ДНК, рестрикційний аналіз сконструйованої плазміди pRS303K-ADH-FPS1-CYC; підготовка середовищ для культивування дріжджів Saccharomyces cerevisiae.

• трансформація S. cerevisiae лінеаризованою плазмідою pRS303K-ADH-FPS1-CYC

• третій-четвертий тиждень (01.10 - 12.10). Відбір дріжджових трансформантів. Виділення геноманої ДНК дріжджів та ПЛР-аналіз на наявність вставки. Підготовка середовищ для крапельних тестів. Крапельні тести на стійкість одержаних трансформантів до спиртів, гіпо- та гіперосмотичного стресу.

• П’ятий-шостий тиждень (15.10 - 26.10). Кінетика росту одержаних дріжджових трансформантів, що надекспресують ген FPS1, у рідкому середовищі з додаванням ізобутанолу.

4. Формування індивідуального завдання

Глобальні енергетичні проблеми та забруднення навколишнього середовища активізували зусилля в напрямі синтезу біопалива з поновлюваних ресурсів. Щороку зростає глобальна продукція найпоширенішого біопалива – біоетанолу [5]. Однак в порівнянні з біопаливним етанолом вищі спирти, зокрема ізобутанол, мають ряд переваг для заміни бензину [1].

Ізобутанол продукується дріжджами як побічний продукт бродіння. Це компонент сивушних масел, які утворюються в результаті неповного метаболізму амінокислот у дріжджів. Проте вихід ізобутанолу у таких процесах є дуже низьким, що, вірогідно, пов’язано з високою токсичністю ізобутанолу для дріжджів [1]. Розуміння молекулярних механізмів, що лежать в основі резистентності та чутливості дріжджів до ізобутанолу, сприятиме розробці раціональних стратегій підвищення ефективності біосинтезу ізобутанолу цими організмами. Тому необхідною є ідентифікація генів стійкості та чутливості до ізобутанолу у дріжджів S. cerevisiae.

Ген FPS1 кодує мембранний аквагліцеропорин Fps1, що опосередковує транспорт води та невеликих молекул таких як гліцерол, оцтова кислота, арсеніт, антимоніт і бор шляхом полегшеної дифузії [2, 3, 7]. Раніше було показано, що ген FPS1 - один із визначальних у стійкості до стресу, спричиненого високими концентраціями етанолу у дріжджів S.cerevisiae [4]. Метою даної роботи було з’ясування ефекту надекспресії гену FPS1 на стійкость клітин дріжджів до ізобутилового спирту та інших спиртів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

• сконструювати плазміду для посилення експресії гена FPS1

• одержати трансформанти дріжджів S. cerevisiae, що надекспресують FPS1

• дослідити стійкість/чутливість одержаних трансформантів до ізобутанолу та інших спиртів