Реакция преципитации

В основе реак­ции лежит образование видимого осадка, состоящего из всту­пивших друг с другом в соединение антител и молекулярных антигенов (например, бактериальных белков или полисаха­ридов, образовавшихся при разрушении микробных тел). По сво­ей сущности реакция преципитации аналогична реакции агглю­тинации. Основным различием между ними является то, что в первом случае применяется корпускулярный антиген, а во втором - антиген представляет собой коллоидное вещество белковой или полисахаридной природы.

Другим существенным различием является то, что агглюти­нация представляет собой количественный метод исследования, с помощью которого устанавливают титр агглютининов, со­держащихся в исследуемой сыворотке крови. Реакция преци­питации является качественным методом исследования, при котором диагностическое значение имеет появление осадка в реагирующих жидкостях.

Для обозначения антигенов, участвующих в реакции преци­питации, принят термин «преципитиноген», для антител - «преципитин», для специфического осадка, образующего в результате реакции - «преципитат». Преципитат, возникающий вследствие укрупнения коллоидных частиц антигена, может иметь вид кольца, формирующегося на границе антигена с им­мунной сывороткой.

Реакцию преципитации используют в следующих целях:

1. для выявления специфических антител в исследуемой сыво­ротке на основе применения определенных антигенов;

2. для обнаружения антигенов белковой или полисахаридной природы с использованием известной, специфической, пре-ципитирующей сыворотки.

Для постановки реакции преципитации необходимы:

1. Сыворотки (исследуемые или иммунные - преципитирующие).

2. Антигены (исследуемые или диагностические).

3. Изотонический раствор хлорида натрия рН 7,0-7,2.

4. Пастеровские пипетки.

5. Преципитационные пробирки (диаметром 2-3 мм и высотой 2-3 см для реакции кольцепреципитации, диаметром 4 мм и высотой 4-6 см для реакции преципитации по типу флокуляции). В узких пробирках реакция преципитации на­ступает значительно скорее и проявляется более четко, чем в пробирках большого диаметра.

Антигены, применяемые для постановки реакции преципи­тации, представляют собой, коллоидные вещества в состоянии тонкой дисперсности, обязательно должны быть в растворимом состоянии. В качестве антигенов для реакции преципитации ис­пользуют фильтраты бульонных культур, экстракты микробных тел, полученные различными способами, «полный» антиген Буавена, экстракты пораженных органов, спинномозговую жид­кость, гной, мокроту и другие материалы, содержащие продукты распада возбудителей болезни.

Преципитирующие сыворотки, приготовленные против различных видов микробов, реагируют с антигенами, получен­ными только от этих видов микробов.

Участвующие в реакции ингредиенты должны быть совер­шенно прозрачны. Для этого их центрифугируют или фильтруют через бактериальный фильтр.

Реакцию преципитации можно ставить в виде смеси различ­ных разведений антигена с антителом или в виде реакции коль­цепреципитации с наслоением одного компонента на другой.

При постановке реакции преципитации в отличие от ре­акций агглютинации титр преципитирующих сывороток оп­ределяют по наибольшему разведению, антигена, при кото­ром еще наблюдается образование преципитата.

В реакции преципитации участвуют частицы коллоидного раствора, величина которых во много раз меньше корпускуляр­ных антигенов и которые для образования видимого преципита­та требуют в 10 000 раз большего количества антител, чем бак­териальные клетки, образующие агглютинат.

Техника постановки реакции преципитации. 1. В штатив устанавливают два ряда преципитационных пробирок. В пробир­ках первого ряда готовят несколько последовательных разведе­ний антигена (степень начального и конечного, разведений оп­ределяется способом приготовления и активностью антигена). Экстракты микробных культур разводят обычно от 2 до 64 раз.

«Полный» антиген Буавена, представляющий собой ком­плекс полисахаридов и липоидов, извлеченных из тела мик­робной клетки, разводят в десятки и сотни тысяч раз.

В каждую пробирку второго параллельного ряда вносят 0,5 мл цельной или разведенной 1:2 преципитирующей сыворот­ки. Затем разведенный антиген, находящийся в пробирках пер­вого ряда, переносят в объеме 0,5 мл в соответствующие пробир­ки второго ряда.

Для предупреждения возможных ошибок при оценке резуль­татов реакции рекомендуется ставить следующие контроли:

1. нормальная сыворотка от животного того же вида, которого иммунизировали для получения преципитирующей сыво­ротки + исследуемый антиген;

2. специфическая преципитирующая сыворотка + изотониче­ский раствор хлорида натрия;

3. специфическая преципитирующая сыворотка + заведомо со­ответствующий, ей антиген.

Смесь антигена с сывороткой после тщательного перемеши­вания ставят на 2 ч в термостат, а затем на 18-20 ч оставляют при комнатной температуре. В случае положительного результата в прозрачной жидкости образуются хлопья преципитата, оседаю­щие в виде рыхлого осадка на дно пробирки. Предельное разве­дение антигена, с которым сыворотка образует преципитат, считается титром сыворотки.

При постановке реакции кольцепреципитации в ряд узких пробирок вносят с помощью пастеровской пипетки по 0,1-0,2 мл сыворотки так, чтобы не смочить ею внутреннюю поверхность стенок пробирки. Затем на поверхность сыворотки наслаивают различные разведения антигена в количестве, равном объему сыворотки, содержащейся в пробирке.

Чтобы не произошло смешивания жидкостей, пробирку в момент наслаивания антигена держат в наклонном положении, а антиген отдельными каплями наливают по внутренней по­верхности стенки, пользуясь для этой цели пастеровской пипет­кой с длинным, очень тонким капилляром. В результате пра­вильного наслоения антигена в пробирке образуются два четко отграниченных, не смешивающихся при стоянии слоя. Реак­ция кольцепреципитации сопровождается постановкой трех обязательных контролей. После добавления антигена пробирки помещают в штатив и оставляют при комнатной температуре.

При положительной реакции преципитации, в течение 5-30 мин на границе соприкосновения двух жидкостей появляется хорошо видимое на темном фоне кольцо молочно-белого цвета.

В контрольных пробирках, за исключением 3-й (специфиче­ская преципитирующая сыворотка + соответствующий ей анти­ген), кольца помутнения не появляются.