Забарвлення днк в агарозних гелях

Застереження: бромистий етидій-сильний мутаген! Усі маніпуляції з гелями і розчинами чи посудом, які містять цей барвник СЛІД ПРОВОДИТИ В СПЕЦІАЛЬНИХ ОДНОРАЗОВИХ РУКАВИЦЯХ!!!

Як зазначалось, найбільш зручним методом візуалізації ДНК в агарозних гелях є забарвлення флуоресціюючим інтеркалятором бромистим етидієм. Молекула цього барвника містить плоску циклічну групу, яка може інтеркалювати між сусідніми азотистими основами нуклеїнових кислот. В результаті інтеркаляції інтенсивність флюоресценції етидію бромистого підвищується. Енергія УФ-випромінювання, яка поглинається ДНК в області 260 нм передається на барвник, після чого барвник флюоресціює променями червоно-помаранчевої області видимого спектру. Слід зазначити, що барвник може флюоресціювати в цій зоні видимого спектру і при безпосередньому опроміненні його молекул в складі ДНК променями з довжиною хвилі 300-360 нм.

Бромистий етидій можна використовувати для виявлення як двох-, так і одноланцюгових молекул нуклеїнових кислот (ДНК та РНК). Щоправда, спорідненість барвника до одноланцюгових нуклеїнових кислот значно нижча, а, відповідно, флюоресценція слабша.

Бромистий етидій можна вносити і в електрофорезний буферний розчин (робоча концентрація 0,5 мкг/мл). Як зазначалось, у присутності цього барвника електрофоретична рухливість лінійних двохланцюгових молекул ДНК знижується приблизно на 15%.

Можна проводити електрофоретичне розділення і за відсутності бромистого етидію і здійснювати забарвлення після електрофорезу. У цьому випадку гель поміщають в електрофорезний буферний розчин або у дистильовану воду, які містять бромистий етидій (0,5 мкг/мл) на 45 хв при кімнатній температурі. При цьому не потрібно додаткового етапу знебарвлення фону, однак, при виявленні малих кількостей ДНК (менше 10 нг) рекомендується знизити фонову флюоресценцію (обумовлену незв’язаним барвником) витримуючи гель в 1 мМ розчині MgSO₄ протягом 1 години при кімнатній температурі.

Приготування агарозних гелів і проведення електрофорезу

Увага: перед проведенням лабораторної роботи перечитайте підрозділи ,,Техніка безпеки” та ,,Забарвлення ДНК в агарозних гелях” та ознайомтесь з ОБОВ’ЯЗКОВИМИ запобіжними засобами при роботі з етидієм бромистим та трансілюмінатором!!!

1. Додайте розраховану кількість порошку агарози у відміряний об’єм відповідного буферного розчину (ТАЕ, ТБЕ або ТФЕ) для електрофорезу.

2. Нагрійте суспензію агарози на киплячій водяній бані до повного розчинення.

3. Охолодіть розчин агарози до 50 ºС і додайте бромистий етидій (з водного розчину, який містить 10 мг/мл; розчин зберігають при +4 ºС в непроникному для світла посуді). Кінцева концентрація бромистого етидію в розчині агарози повинна становити 0,5 мкг/мл.

4. Підготуйте форму для заливки агарозного геля: встановіть форму на горизонтальній поверхні на листку паперу; відповідним чином закріпіть над формою гребінку для формування лунок для проб - щоб між зубцями гребінки і дном форми залишалось 1-1,5 мм.

5. Вилийте розчин агарози в підготовану форму для формування геля.

6. Після того, як гель остаточно затвердіє (20-45 хв - за кімнатної температури), обережно видаліть гребінку і помістіть гель на платформі приладу для електрофорезу.

7. Додайте необхідну кількість буферного розчину для проведення електрофорезу (ТАЕ, ТБЕ, ТФЕ; буферний розчин повинен бути однакового складу з відповідним розчином для приготування агарозного геля). Шар буферного розчину повинен покривати агарозний гель щонайменше на 1 мм.

8. Змішайте проби ДНК з відповідним об’ємом 6-ти кратного буферного розчину для нанесення проб. Внесіть приготовані проби в лунки геля під електрофорезним буферним розчином.

9. Закрийте прилад для електрофорезу кришкою і підключіть до джерела струму. Встановіть відповідні показники сили струму та напруги (не більше 5 В/см довжини гелю!!!).

10. Після електрофоретичного розділення нуклеїнових кислот перенесіть гель на трансілюмінатор і сфотографуйте. Кількісну обробку отриманих результатів здійсніть за допомогою комп’ютерної програми TotalLab v2.01.

Максимальна кількість проби нуклеїнових кислот, яку можна внести в лунку залежить від числа фрагментів ДНК чи РНК в пробі та від їх молекулярної маси. Мінімальна кількість ДНК, яку можна виявити при фотографуванні геля бромистим етидієм становить близько 2 нг, при ширині полоси 0,5 см. Якщо лунка буде переповнена і в полосі зазначеної ширини буде міститись більше 200 нг ДНК, то полоса буде розмитою з характерним шлейфом. Цей недолік особливо виражений при розділенні великих фрагментів ДНК.

При аналізі простого набору молекул ДНК в лунку довжиною 0,5 см вносять 0,2-0,5 мкг сумарної ДНК. Якщо проби містять дуже велику кількість фрагментів ДНК різних розмірів (наприклад, суміш продуктів рестрикційного аналізу геномної ДНК еукаріот), то в лунку можна внести 5-10 мкг сумарної ДНК.

Контрольні запитання.

1. Назвіть і охарактеризуйте 5 головних параметрів які впливають на швидкість та ефективність електрофоретичного розділення нуклеїнових кислот в агарозному гелі.

2. Охарактеризуйте принципи візуалізації нуклеїнових кислот в агарозних гелях після електрофоретичного розділення.

3. Протягом попередніх двох лабораторних робіт Ви провели ПЛР-ампліфікацію за допомогою відповідних тест-наборів та рестрикцію ДНК бактеріофага λ. Охарактеризуйте продукти ПЛР та рестрикції візуалізовані після розділення в агарозі.

4. Проаналізуйте склад буферних розчинів для нанесення проб нуклеїнових кислот (таблиця 3), поясніть призначення окремих складових.

5. Проаналізуйте склад буферних розчинів для проведення горизонтального електрофорезу (таблиця 2), поясніть призначення окремих складових.