Київський національний університет імені Тараса Шевченка
ННЦ ,,Інститут біології”
Кафедра біохімії
Лабораторна робота
,,ПРОВЕДЕННЯ ЕЛЕКТРОФОРЕТИЧНОГО РОЗДІЛЕННЯ ДНК В АГАРОЗНОМУ ГЕЛІ”
З КУРСУ “БІОТЕХНОЛОГІЯ”
для студентів денної форми навчання
Затверджено на засіданні
кафедри біохімії,
протокол №___
від “__” _________2012р.
Упорядники:
к.б.н., асист. Мандрик С.Я.
Київ – 2012
Умовні позначення:
Трис |
– |
трис-(оксиметил)-амінометан ((HOCH2)3CNH2); |
(50×), (30×), (10×) тощо |
– |
позначення кратності концентрованих розчинів - відповідно, 50-, 30-ти та 10-ти кратні концентровані розчини |
ЕDТА |
– |
етилендиамінтетраацетат; |
мРНК |
– |
матрична рибонуклеїнова кислота; |
УФ-випромінювання |
– |
ултрафіолетове випромінювання |
|
|
|
Техніка безпеки
Усі маніпуляції, які включають:
- приготування розчину етидію бромистого;
- внесення розчину етидію бромистого в розчин агарози;
- заливку агарози у форму для геля;
- переміщення агарози у прилад для горизонтального електрофорезу;
- контроль розділення нуклеїнових кислот та фотографування геля за допомогою трансілюмінатора;
- утилізацію використаного агарозного геля
ПРОВОДЯТЬ В СПЕЦІАЛЬНИХ ОДНОРАЗОВИХ РУКАВИЦЯХ, А ЗА НЕОБХІДНОСТІ - ПІД ВИТЯЖНОЮ ШАФОЮ!!! Етидій бромистий -є СИЛЬНИМ МУТАГЕНОМ, тому слід попередити потрапляння цієї речовини на шкіру, або слизові оболонки. У випадку потрапляння етидію бромистого на шкіру або слизові оболонки необхідно промити водою і звернутись до викладача за подальшими вказівками.
Фотографування гелів і візуальний контроль розділення нуклеїнових кислот за допомогою трансілюмінатора ЗДІЙСНЮЮТЬ В СПЕЦІАЛЬНИХ ОКУЛЯРАХ АБО ЗА ДОПОМОГОЮ ЗАХИСНОГО ЕКРАНУ!!! Ультрафіолетове випромінювання трансілюмінатора згубно впливає на слизові оболонки, зокрема слизові оболонки ока!
Загальні відомості про електрофоретичне розділення нуклеїнових кислот в агарозних гелях
Електрофоретичне розділення в агарозному гелі - стандартний метод, який використовується для розділення, ідентифікації та очистки ДНК та РНК. Під час електрофоретичного розділення в гелі можна безпосередньо моніторити положення зразків ДНК чи РНК - оскільки полоси нуклеїнових кислот в гелі можна візуалізувати за допомогою флюоресціюючого та інтеркалюючого барвника етидію бромистого. За допомогою бромистого етидію в ультрафіолетових променях візуально можна виявити близько 0,1 мкг нуклеїнових кислот.
При електрофоретичному розділенні швидкість міграції нуклеїнових кислот в агарозному гелі залежить від 5 головних параметрів: розмірів молекул нуклеїнових кислот; концентрації агарози; конформації нуклеїнових кислот; показника напруги електричного поля; вмісту азотистих основ і температури.
Розмір молекул нуклеїнових кислот. Швидкість руху лінійних молекул нуклеїнових кислот в агарозному гелі обернено пропорційна десятковому логарифму їх молекулярних мас.
Концентрація агарози. Між логарифмом електрофоретичної рухомості ДНК (μ) і концентрацією агарози геля (τ) існує пряма залежність, яка описується рівнянням
,
де μ0 - вільна електрофоретична рухомість, а константа Кr називається коефіцієнтом сповільнення і залежить від властивостей геля і від розмірів та форми молекул нуклеїнових кислот. Нижче наведено концентрації агарози в гелі, які використовуються для розділення молекул ДНК різного розміру (таблиця 1).
Таблиця 1. Приготування агарозних гелів різної концентрації для розділення відповідних фрагментів ДНК
Концентрація агарози в гелі (%) |
Область розмірів лінійних молекул ДНК (kb), які ефективно розділяються |
0,3 |
60-5 |
0,6 |
20-1 |
0,7 |
10-0,8 |
0,9 |
7-0,5 |
1,2 |
6-0,4 |
1,5 |
4-0,2 |
2,0 |
3-0,1 |
3,0-4,5 |
менше 0,1 kb |
Конформація нуклеїнових кислот. Молекули ДНК з однаковою молекулярною масою але різними конформаціями рухаються в агарозному гелі з різними швидкостями. Наведемо приклад: необхідно розділити три форми ДНК з однаковою молекулярною масою - кільцеву (форма І), кільцеву з одноланцюговим розривом (форма ІІ) і лінійну (форма ІІІ). Перш за все, показники відносної рухомості трьох форм ДНК залежать від концентрації агарози в гелі, а також, від таких факторів, як сила струму, іонна сила буферного розчину та кількість суперспіральних витків у молекулах ДНК (зокрема, для форми І). За одних умов форма І рухається швидше, за інших - повільніше в порівнянні з формою ІІІ. Щоб однозначно визначити конформацію ДНК необхідно провести електрофоретичне розділення у присутності зростаючих концентрацій барвника етидію бромистого. Зі збільшенням концентрації барвника зростає кількість молекул етидію бромистого, які зв’язуються з ДНК. При цьому кількість негативних супервитків спіралі ДНК у формі І поступово знижується, а швидкість руху молекул форми І в гелі також знижується. За критичної концентрації молекул барвника (коли в ДНК більше не залишається суперспіральних витків), швидкість руху форми І сягає мінімальних значень. Наступне внесення нових порцій етидію бромистого призводить до утворення позитивних супервитків - в результаті рухомість форми І починає зростати. Показники рухомості форм ІІ та ІІІ при збільшенні концентрації барвника знижуються (по-різному) - це також відбувається внаслідок нейтралізації зарядів і збільшення жорсткості молекул ДНК під впливом бромистого етидію. Додатково, слід зазначити, що для більшості препаратів ДНК форми І, критична концентрація бромистого етидію (поява позитивних супервитків і збільшення рухомості) знаходиться в області концентрацій 0,1-0,5 мкг/мл.
Показник напруги електричного поля. За низьких значень напруги швидкість переміщення в гелі лінійних фрагментів ДНК прямопропорційна напрузі. Однак, зі збільшенням напруги електричного поля рухливість фрагментів ДНК з високою молекулярною масою зростає експоненційно. Відповідно, зі збільшенням напруги ефективне розділення фрагментів ДНК в агарозному гелі знижується. Максимальна ефективність розділення фрагментів ДНК спостерігається при напрузі, яка не перевищує 5 В/см довжини гелю.
Вміст азотистих основ і температура. Електрофоретична рухомість ДНК в агарозних гелях (на відміну від поліакриламідних гелів) слабко залежить від складу азотистих основ і від температури геля. В агарозних гелях в області температур від +4 до +30 ºС не відбувається зміни рухомості фрагментів ДНК різного розміру. Зазвичай, електрофоретичне розділення фрагментів ДНК проводять при кімнатній температурі. Однак, слід зазначити, що гелі, які містять менше 0,5% агарози дуже м’які - тому з такими гелями краще працювати при температурі +4 ºС.