2. Реакция связывания комплемента (рск): этапы реакции, методика определения рабочей дозы комплемента, подготовка гемолитической системы

Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при наличии специфич­ности антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент анти­тел присоединяется комплемент, то есть происходит связывание комплемента комплексом ан­тиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент остается свободным. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компо­нента: антиген, антитело и комплемент; 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свобод­ного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при об­разовании комплекса антиген-антитело (специфичности антигена и антител) происходит связы­вание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритро­цитов не произойдет, реакция считается положительной. Если специфичность антигена и ан­тител не соответствуют друг другу, то комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоеди­нится к комплексу эритроцит-антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз, реакция счита­ется отрицательной. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в част­ности риккетсиозов, гонореи, коклюша, сифилиса (реакция Вассермана).

2. Реакции нейтрализации

Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие мик­робов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией. Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген-антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру кле­ток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микро­организмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыво­ротки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело.

III. План практической работы

1. Изучить технику постановки и учесть реакцию преципитации (РП) в геле с целью опреде­ления токсигенности дифтерийной палочки (РН токсина антитоксической сывороткой).

Полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной

сывороткой, накладывают на поверхность прозрачного агара в чашке Петри. Культуры дифте­рийной палочки сеют бляшками на расстоянии 0,6-0,8 см от полоски фильтровальной бумаги и 1-1,5 см друг от друга. Исследуемые и контрольную (токсигенную) культуры дифтерийной па­лочки чередуют с одной стороны полоски фильтровальной бумаги, а напротив, с другой сторо­ны полоски сеют одноименные культуры (дубли). Чашку инкубируют при 37°С в течение 24-48 часов. Затем проводят учет. Положительной реакция считается при наличии тонкой ли­нии преципитата между полоской фильтровальной бумаги и ростом бактерий в виде бляшки, отрицательной — при её отсутствии. Реакция считается специфичной, если контрольная куль­тура дала положительный результат.

2. Поставить и учесть реакцию кольцепреципитации Асколи в диагностике сибирской язвы

(с целью обнаружения антигенов возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале).

Из органов трупа животного (селезенки, участков воспаления и геморрагий кишечной

Ингредиенты	Рабочая пробирка	Отрицательный контроль сыво­ротки	Положительный контроль сыворотки	Контроль термоэкс­тракта
Исследуемый материал (термоэкс­тракт из органов животного)	+			+
Диагностикум (стандартный сиби­реязвенный антиген)			+
Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка (на дно)	+	+	+
Нормальная сыворотка животного (на дно)				+
Изотонический раствор NaCl		+

В случае наличия антигенов возбудителя сибирской язвы в термоэкстракте на границе между жидкостями появляется мутно-белое кольцо преципитата не позднее, чем через 15 ми­нут.

3. Изучить схему постановки и учесть РСК в серодиагностике сыпного тифа.

Реакция связывания комплемента (РСК) — это сложная многокомпонентная серологи­ческая реакция, в которой используются две системы АГ- AT (исследуемая и индикаторная) и комплемент в рабочей дозе.

Первую систему называют исследуемой или тест-системой, она содержит один неизвест­ный компонент (исследуемая сыворотка, в которой определяется наличие антител) и известный компонент (диагностикум). Вторую систему называют индикаторной или гемолитической (эритроциты барана + антитела сыворотки кролика). РСК проходит в два этапа:

1. тест-система (№1) + комплемент— 1 час инкубации при 37°С

2. добавляют гемолитическую систему (№ 2) — 1 час инкубации при 37°С

РСК имеет много компонентов, поэтому ставят несколько контролей. Все компоненты используют в эквивалентных количествах. Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента для определения его рабочей дозы, так как при этой реакции необхо­димо точное соблюдение количественных соотношений ингредиентов.