Макрофаги и поддержка воспалительного процесса

• Роль макрофагов в очаге воспаления может заключаться во-первых, в поддержке воспалительного процесса, в частности, альтеративных и экссудативных нарушений; во-вторых – в регуляторном обеспечении репарации.

• Участие макрофагов в процессах альтерации (вторичной) и экссудации обусловлено их способностью к продукции и секреции флогогенных факторов – «медиаторов воспаления», включая хемокины, провоспалительные цитокины, компоненты системы комплемента, метаболиты арахидоновой кислоты, продукты кислородного взрыва, факторы гемокоагулации и ферменты.

ПРОДУКТЫ СЕКРЕЦИИ МАКРОФАГОВ В РЕАЛИЗАЦИИ

АЛЬТЕРАТИВНЫХ И ЭКССУДАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ

Хемокины

Цитокины

ИЛ-8; IP-10; MCP-1, 2, 3; MIP1; MIP1β; RANTES

ИЛ-1; ФНОα; ИЛ-6;

ИЛ-8; ИНФα; ИНФβ;

Г-М - , Г-, М-КСФ

«профессиональные» хемотаксины для привлечения нейтрофилов, моноцитов, МФ и др. клеток (Т-лимфоцитов)

влияние на систему микроциркуляции, хемотаксис, метаболизм, гемокоагулацию;

обеспечение иммунных реакций;

стимуляция грануло- и моноцитопоэза

Метаболиты АК

PG E₂; LT B₄, C₄; тромбоксан А₂; 5 HETE;

15 HETE

Факторы

гемокоагулации

влияние на систему микроциркуляции и иммунный ответ;

хемотаксис и активация лейкоцитов

V, VII, IX, X;

протромбиназа

свертывание крови и смежные процессы

Ферменты

Компоненты системы комплемента

нейтральные протеиназы, кислые гидролазы, лизоцим, лактопероксидаза

С 1-9; С 3а; С3b; С 5а; Bb; пропердин; факторы В; D

разрушение тканевого дедрита;

бактерицидное, тумороцидное действие

влияние на систему микроциркуляции;

эффекторные реакции иммунитета;

хемотаксис; ₁

бактериолиз; цитолиз

Продукты

«кислородного взрыва»

О₂; Н₂О₂; НО^•

влияние на систему микроциркуляции;

бактерицидное и цитостатическое действие

• Макрофаги способны не только поддерживать воспалительный процесс, но и обеспечивать его подавление, что является необходимым условием для последующей успешной репарации.

ПРОДУКТЫ СЕКРЕЦИИ МАКРОФАГОВ В ОГРАНИЧЕНИИ АЛЬТЕРАТИВНЫХ И ЭКССУДАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ

Ингибиторы протеаз

Ингибиторы хемотаксиса

₁ - антитрипсин; ₂ – макроглобулин; ингибиторы плазмина; ингибиторы активатора плазминогена

₂ – макроглобулин

ограничение мобилизации клеточных участников воспаления

лимитирование вторичной альтерации и активации каскадных протеолитических систем плазмы крови

Ингибиторы комплемента

фактор Н; фактор I

ограничение участия комплемента и его фрагментов в воспалении

Ингибитор фосфолипаз

липомодулин

Гепарин

угнетение синтеза метаболитов АК

снижение активности ККС;

связывание биогенных аминов;

ингибирование адгезии и агрегации клеток

Металлопротеиназы

инактивация цитокинов (ИЛ-1β);

«слущивание» с поверхности клеток провоспалительных цитокинов (ИЛ-6; ФНО) и рецепторов к ним

Антиоксиданты

₂ – макроглобулин;

сывороточный амилоид А;

церулоплазмин;

гемопексин, гаптоглобин, С-реактивный белок

Противовоспалительные

цитокины

ограничение ПОЛ и повреждения клеточных мембран

ИЛ-10

снижение продукции провоспалительных цитокинов;

подавление экспрессии МНС 2;

подавление ГЗТ

Регуляторные пептиды

β – эндорфины

противовоспалительный эффект

МАКРОФАГИ И РЕПАРАЦИЯ

• Репаративные процессы сводятся к регенерации и фиброплазии. Регенерация – это замена утраченных клеток клетками того же типа. Если полное количественное восстановление паренхиматозных клеток невозможно (из-за неспособности последних к делению), осуществляется фиброплазия – восполнение дефекта паренхимы соединительной тканью.

• Оба этих процесса в очаге воспаления достигаются как через усиление пролиферации, так и путем ограничения апоптоза.

• Стимуляторами пролиферации и ингибиторами апоптоза выступают факторы роста – цитокины, продуцируемые мезенхимальными клетками (макрофагами, лимфоцитами, тромбоцитами, эндотелиоцитами, гладкомышечными клетками, фибробластами) – главными универсальными участниками репаративных процессов. Среди этих участников макрофагам принадлежит ведущая роль.

• Эта роль реализуется прежде всего за счет способности макрофагов к продукции и секреции различных факторов роста (цитокинов) и ростстимулирующих гормонов (СТГ; инсулинозависимые факторы роста – ИФР-I и II), усиливающих пролиферацию фибробластов – главных эффекторов репаративной стадии воспаления.

• Во-вторых, участие макрофагов в регуляции репарации обусловлено продукцией этими клетками нейтральных протеиназ (эластазы, коллагеназы). Расщепляя соответствующие структуры матрикса соединительной ткани, эти ферменты обусловливают саморегуляцию синтеза ее компонентов на основе механизма обратной связи. С участием данных протеиназ осуществляется удаление с поверхности фибробластов фибронектина, что может служить сигналом к отмене контактного торможения их пролиферации, а также обеспечивать повышение чувствительности клеток к факторам роста.

• В-третьих, макрофаги осуществляют синтез и секрецию коллагенассоциированных клейких гликопротеидов (фибронектин, тромбоспондин) и протеингликанов. При участии данных веществ – «молекулярных переходников» осуществляется связь компонентов внеклеточного матрикса с клеточными мембранами. Особенно важна роль фибронектина – центральной адаптерной молекулы самосборки тканей, обеспечивающей формирование первичного каркаса с определенной ориентацией фибробластов и коллагеновых волокон в зоне репарации.

• В-четвертых, участие макрофагов в регуляции репаративных процессов не ограничивается их стимуляцией. Макрофаги способны также к регуляторному подавлению фиброплазии за счет продукции и секреции ингибиторов пролиферации (ФНО и ТФРβ).

• В-пятых, регуляторное влияние макрофагов распространяется и на паренхиму, хотя конкретные механизмы этого влияния не определены.

• Успешное развитие репарации напрямую связано с ангиогенезом, в котором центральная роль также принадлежит макрофагам, обеспечивающим этот процесс.

ПРОДУКТЫ СЕКРЕЦИИ МАКРОФАГОВ В РЕАЛИЗАЦИИ

РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ

Факторы роста

Коллагенассоциированные клейкие гликопротеиды и протеигликаны

фактор роста фибро-бластов - ФРФ;

тромбоцитарный фактор роста - ФРТ;

трансформирующий фактор роста - ТФР β (в низких концентрациях)

фибронектин, тромбо-спондин, гепарин, хондроитинсульфаты

формирование первичного каркаса с определенной ориентацией фибробластов и коллагеновых волокон в зоне репарации;

связывание компонентов межклеточного матрикса с клеточными мембранами

стимуляция пролиферации фибробластов

Гормоны

СТГ; ИФР-I; ИФР-II

стимуляция пролиферации фибробластов, эндотелиоцитов

Нейтральные

протеиназы

Ингибиторы

пролиферации

эластаза; коллагеназа

трансформирующий фактор роста - ТФР β (в высоких концентрациях);

ФНОα

саморегуляция синтеза и распада коллагена на основе обратной связи;

предупреждение избытка накопления коллагена в рубцовой ткани

угнетение пролиферации фибробластов;

предупреждение избыточности фиброгенеза

Рекрутирование и активация лимфоцитов

регенерация паренхимы

ПРОДУКТЫ СЕКРЕЦИИ МАКРОФАГОВ В АНГИОГЕНЕЗЕ

Факторы роста

эндотелия

Металлопротеиназы

преобразование внеклеточного матрикса: разрушение коллагена, эластина и других его компонентов;

врастание сосудов во внеклеточный матрикс

VEGF

пролиферация и миграция эндотелиоцитов

Индукторы продукции и секреции VEGF

ИЛ-1; ФНО

Урокиназный активатор плазминогена

увеличение локальной концентрации VEGF

активация

металлопротеиназ

Другие факторы роста с ангиогенным эффектом

Тканевой ингибитор металлопротеиназ

фактор роста фибробластов – ФРФ;

тромбоцитарный фактор роста – ФРТ;

фактор роста гепатоцитов - ФРГ

TIMPs

ограничение избыточного разрушения внеклеточного матрикса

пролиферация и миграция эндотелиоцитов

Ингибиторы ангиогенеза

TФPβ

ограничение избыточности ангиогенеза

Лабораторный практикум

Задание 1. Изучение фагоцитоза птичьих эритроцитов в перитонеальном экссудате морской свинки (Опыт И. И. Мечникова)

Необходимые животные и оборудование на 1 рабочее место:

1. Морская свинка.

2. % взвесь птичьих эритроцитов (петуха) на физиологическом растворе хлористого натрия.

3 Шприц объемом 5,0 мл.

4. Пастеровская пипетка.

5. Ножницы.

6. Пинцет хирургический.

7. Предметное стекло с лункой-

8. Покровное стекло.

9. Вазелин в фарфоровом тигле (1,0 г) и стеклянная палочка.

10. 0,02% раствор краски нейтральрот.

11 Микроскоп (ок. 7-10, об. 8 и 90).

12. Иммерсионное масло.

13. Предметное стекло.

14. Предметное стекло со шлифованными краями.

15. Жидкость Нлкифорова (спирт пополам с эфиром) -- 2 мл.

16. Краска Романовского - 2 мл.

17. Пипетка объемом 5,0 мл. (2 шт.).

18. Ванночка со стеклянным мостиком-

19. Дистиллированная вода - 200 мл.

20. Фильтровальная бумага (1 фильтр).

Ход исследования:

За сутки до занятия морской свинке вводят внутрибрюшинно 8 - 10 мл стерильного мясо-пептонного бульона. При этом возникает асептическое воспаление, в перитонеальном экссудате скапливается большое количество макрофагов. Во время занятия морской свинке внутрибрюшинно вводят 5 - 8 мл 5%, взвеси птичьих эритроцитов, подогретых до 38^о С. Птичьи эритроциты являются объектом фагоцитоза.

Через 1 час после введения птичьих эритроцитов у подопытного животного ножницами разрезают кожу живота по средней линии. В месте надреза стерильной пастеровской пипеткой прокалывают брюшину. В силу капиллярности перитонеальный экссудат заполняет пипетку. Из этого экссудата готовят 2 препарата: 1 - висячую каплю, 2 - фиксированный мазок

Приготовление висячей капли

3 - 5 капель экссудата помещают на часовое стекло и смешивают с равным количеством краски нейтральной красной (нейтральрот). На покровном стекле делают ободок из вазелина и в центре помещают каплю экссудата, смешанного с краской. Покровное стекло накрывают другим стеклом с лункой. Затем весь препарат переворачивают покровным стеклом вверх, при этом капля экссудата повисает над лункой. При таком методе окраски клеток экссудата поврежденные макрофагом птичьи эритроциты (реакция ферментолиза) окрашиваются в красный цвет, что указывает на изменение реакции внутри клетки в кислую сторону. Неповрежденные клетки в перитонеальном экссудате морской свинки не прокрашиваются этой краской. Рассматривают препарат под микроскопом при увеличении 10х8.

Приготовление мазка из перитонеального экссудата

Каплю экссудата наносят на предметное стекло и с помощью стекла со шлифом делают мазок. Высохший мазок помещают на стеклянный мостик и наливают на него жидкость Никифорова (фиксация мазка). Фиксацию проводят в течение 15 - 20 минут. По мере высыхания фиксирующую жидкость добавляют на поверхность мазка. Затем оставшуюся жидкость сливают в ванночку и на поверхность мазка пипеткой наливают краску Романовского. Окрашивание мазка производят также в течение 15 - 20 минут. Далее мазок промывают водой (дистиллированной или водопроводной), сушат (с противоположной стороны мазка стекло можно осушить фильтровальной бумагой. Затем Мазок рассматриваем под микроскопом (ок. 10, об. 90). Зарисавывают все стадии фагоцитоза.

Задание 2. Получение физико-химической модели химиотаксиса

(Опыт Данилевского)

Необходимое оборудование на 1 рабочее место:

1. Чашка Петри.

2. 3% раствор азотной кислоты - 20 мл.

3. Кристаллы двухромовокислого калия - 1 кристалл.

4. Ртуть металлическая - 1 капля.

5. Пинцет анатомический.

Ход исследования:

В чашку Петри наливают 15 - 20 мл 3% раствора азотной кислоты и помещают каплю ртути. На некотором расстоянии от капли ртути помещают кристалл двухромовокислого калия. По мере растворения кристалла изменяется форма капли ртути - она становится амебовидной и начинает передвигаться по направлению к кристаллу, обтекает его, что в некотором отношении напоминает биологическое явление - фагоцитоз.

Рассматривают причины изменения физико-химического состояния ртути в данном опыте, а также значение этих явлений в реакций фагоцитоза в организме.

Задание 3. Исследование клеток гнойного экссудата

Необходимое оборудование на 1 рабочее место:

1. Микроскоп (ок. 10, об. 90).

2. Гной или мазки гноя.

3. Иммерсионное масло.

4. Предметное стекло (2 шт.).

5. Жидкость Никифорова - 2 мл.

6. Краска Романовского - 2 мл.

7. Ванночка с мостиком.

8. Пипетка глазная (2 шт.).

Опыт ставят в порядке демонстрации для всей студенческой группы.

На предметном стекле готовят мазок гноя, сушат на воздухе, фиксируют в жидкости Никифорова (20 минут) и окрашивают краской Романовского (20 минут). Затем краску смывают водой, мазок высушивают с обратной стороны фильтровальной бумагой и рассматривают его под микроскопом с увеличением ок. 7, об. 90.

В мазке находят и зарисовывают ряд клеток

1. Эндотелиальные клетки - большие округлые элементы, расположенные одиночно или группами. Граница отдельных клеток при групповом их распределении выражена нечетко, рельефно выступают только ядра.

2. Лейкоциты, количество которых значительно варьирует. При острых процессах основную массу лейкоцитов составляют нейтрофилы. Кроме того, в гное встречается много макрофагов-моноцитов.

3. Немногочисленные эритроциты более или менее нормального строения.

4. Микроорганизмы.

5. Нити фибрина.

6. Капли жира и гликогена.

Контрольные вопросы:

1. Ранние и поздние компоненты воспалительного инфильтрата. Роль различных видов лейкоцитов в очаге воспаления. Фагоцитоз и экзоцитоз. Полиморфноядерные лейкоциты в формировании начальной стадии воспалительного инфильтрата.

2. Пролиферация. Репаративная стадия воспаления. Молекулярный, клеточный, тканевой и организменный уровни регуляции репаративных процессов. Значение цитокинов и ростовых факторов в регуляции репаративных процессов. Значение цитокинов и ростовых факторов в трансформации инфильтративной стадии в гранулематозную (ИЛ8, ФНО.ТРФр).

3. Системные проявления воспалительной реакции. Их соотношение с местными признаками воспаления.

4. Биологическое значение воспаления. Роль И.И.Мечникова в развитии учения о воспалении.