Література:

1 Карташов І.І Шарапа. Г.С. Акушерство гінекологія і штучне осіменіння сільськогосподарських тварин. – К.: Вища школа 1991.

2 Михайлов Н.Н. Акушерство гинекология и искусственное осеменение сельськохозяйственних животних М.: Агропромиздат 1990.

3 Яблонський В.М. Практичне акушерство гінекологія та біотехнологія відтворення тварин з основами андрології. - К.: Мета 2002.

4.Бойко А.В. Штучне осіменіння сільськогосподарських тварин з основами акушерства. Практикум К.: Вища школа 2000.

Правила охорони праці та особистої гігієни: Практичну роботу проводити в спецодязі. Працювати на закріпленому місці. Дотримуватись правил роботи з мікроскопом, лабораторним посудом, реактивами. Після роботи слід вимити з милом руки і витерти їх рушником.

Короткі відомості з теоретичної частини: Для успішного осіменіння свійських тварин необхідно своєчасно проводити оцінку якості сперми, яка включає в себе загальну санітарну оцінку та мікроскопічну. Отриману сперму після перевірки, розбавляють, заморожують і направляють для тривалого зберігання в рідкому азоті.

Тільки якісна сперма придатна для осіменіння. Свіжо отримана сперма має температуру тіла плідника, тому дослідження оцінки якості сперми повинні бути наближені до природних умов.

Методичні вказівки: Після пояснення студентам мети та завдань заняття, характеристики методів та демонстрації викладачем основних прийомів оцінки сперми студенти розділяються на підгрупи (2 – 3 чол) і виконують визначені їм завдання.

Зміст і послідовність виконання завдань:

1.Провести загальну санітарну оцінку якості сперми.

2.Провести мікроскопічну оцінку якості сперми.

3.Підготуйте розріджувач та розбавте сперму.

4.Ознайомитися з способами тривалого зберігання сперми в рідкому азоті.

5.Оволодіти з методикою розморожування сперми в гранулах.

Хід роботи.

Завдання № 1.

Проведіть загальну санітарну оцінку еякуляту та зіставте дані оцінки з наведеними у таблиці показниками нормальної сперми.

Сіруватий чи голубуватий відтінок сперми свідчить про олігоспермію (низьку концентрацію сперміїв), жовтий – домішки сечі, рожевуватий, червонуватий чи навіть темно – червоний – домішки крові, зеленкуватий – про наявність у ній гною.

При хронічних гнійних процесах у сім’яниках чи їх придатках сперма може мати гнійних запах. Сперму, що не відповідає зазначеним показникам, вибраковують.

Показники нормального еякуляту.

Вид	Колір	Об’єм еякуляту, мл	Запах	Консистенція
Баран Бугай Кнур Жеребець	Білий Білувато – жовтуватий Молочно – білий сіруватий Сірувато - білий	0,8 – 2 3– 5 250 – 500 40 - 120	Жиропоту Свіжого молока - -	Сметаноподібна Вершкоподібна Водяниста з домішками клейких драглистих зерен Водяниста з домішками слизу

Завдання № 2.

Визначення густини сперми.

Під густою сперми розуміють ступінь насичення її сперміями. Визначення густини сперми проводять окомірно в роздавленій краплі за допомогою мікроскопа при збільшенні у 180 – 300 разів. Для повторного виявлення активності сперміїв оцінку проводять при температурі 30 – 40С застосовуючи нагрівальний столик Морозова.

На чисте предметне скло стерильною скляною паличкою чи очною піпеткою нанесіть краплю досліджуваної сперми. Накрийте її покривним склом так, щоб вона заповнила увесь простір під склом, але не витікала за його краї і в ній не було б бульбашок повітря. Покладіть препарат на предметний столик мікроскопа, чи на нагрівальний столик і, розглядаючи його при збільшенні в 180 – 300 разів, добийтеся чіткої видимості сперміїв. Визначте густину сперми в кількох полях зору і з’ясуйте, чи відповідає вона мінімальним вимогам для сперми даного виду тварин.

Відсутність чи дуже мала кількість сперміїв у спермі вважається аспермією (А) чи олігоспермією (О).

Завдання № 3.

Визначення активності сперміїв.

Під активністю сперміїв розуміють здатність їх до прямолінійно – поступального руху. Оцінку активності сперміїв проводять в роздавленій краплі за 10 – бальною системою одночасно з визначенням густоти сперми: за кожних 10% сперміїв із прямолінійно – поступальним рухом ставлять один бал (якщо усі спермії рухаються прямолінійно – поступально – ставлять 10балів, 90% - 9; 80% - 8 і т.д.; якщо таких спермії менше 10% - ставлять один бал), а коли в полі зору лише окремі рухомі спермії, їх позначають буквами ПР (поодинокі рухомі); при наявності сперміїв лише з манежним рухом – буквою М, з коливальним – К. Якщо всі спермії нерухомі – ставлять букву Н (некроспермія).

У такій же роздавленій краплі сперми, в якій визначали густоту сперми, визначте окомірно, скільки процентів сперміїв у полі зору мають прямолінійно – поступальний рух. Оцініть його в балах за десятибальною системою.

Запишіть результати другого та третього завдання двома знаками, наприклад: Г – 9, С – 8.

Завдання № 4.

Визначення кількості живих і мертвих сперміїв (%) методом диференціювального фарбування.

Оболонка живих рухливих сперміїв непроникна для деяких мікробіологічних фарб, тоді як у мертвих та ослаблених сперміїв вона пропускає барвники. Тому в пофарбованому мазку сперми, живі спермії будуть виглядати блідими, не пофарбованими, а мертві, навпаки, набувають кольору фарби.

На чисте знежирене предметне скло, ближче до одного кінця, нанесіть стерильною скляною паличкою чи піпеткою невелику краплю сперми і поряд з нею краплю 5%-ного розчину еозину на 3% - ному розчині цитрату натрію. Швидко перемішайте краплі краєм шліфованого скла. Дещо відступивши, притисніть торцевий край скла із залишками суміші до предметного скла під кутом 40 – 45º і швидким плавним рухом його потягніть до протилежного кінця скла. Мазок повинен бути таким тонким, щоб міг швидко висохнути на повітрі.

Розгляньте його при збільшенні в 400 – 500 разів. Спермії, які під час фарбування були живими, мають незабарвлені головки, у той час як головки мертвих сперміїв забарвлюються у рожевий колір.

Підрахуйте в кількох полях зору підряд 500 сперміїв, рахуючи окремо живих і мертвих. Визначте процент живих сперміїв (П) за формулою: П = (Ж х 100): 500, де П – процент живих сперміїв; Ж – кількість підрахованих живих сперміїв.

Завдання № 5.

Визначення кількості патологічних сперміїв (%).

У кожному еякуляті поряд з нормальними сперміями можуть зустрічатися й патологічні. При виникненні хворобливих процесів у статевих залозах самців кількість патологічних форм збільшується (тератоспермія), що різко знижує запліднювальну здатність самця. Свіжо одержану сперму для зручності підрахунку розріджують 1% - ним розчином хлористого натрію: барана – у 20 – 30 разів; бугая в 10 – 15; жеребця і кнура – в 2 – 3 рази або зовсім не розріджують. Для цього до краплі сперми очною піпеткою додають відповідну кількість крапель 1% - ного розчину хлористого натрію і обережно перемішують.

Візьміть невеличку краплю відповідно розрідженої сперми і нанесіть її на кінець знежиреного й сухого предметного скельця і зробіть з неї тоненький мазок. Висушіть його і зафіксуйте нанесенням спирту – ректифікату на 1 – 2 хвилини. Сполосніть дистильованою водою і фарбуйте розчином азуреозину чи метиленової синьки 3 – 5 хв.

Змийте фарбу водою, висушіть мазок і розгляньте його під мікроскопом при збільшенні в 600 разів. У кожному полі зору підрахуйте і запишіть кількість нормальних і патологічних сперміїв, при цьому загальна кількість тих та інших повинна становити не менше 500. Кількість патологічних сперміїв (%) визначте за формулою: ПС% = (П х 100): (П + Н), де П – кількість підрахованих патологічних форм сперміїв; Н – кількість нормальних сперміїв.

Цей показник в (%) не повинен перевищувати у спермі барана 14, бугая 18, жеребця і кнура – 20.

Завдання № 6.

Приготування розріджувачів та розбавлення сперми.

Посуд та інше приладдя мають бути чистими і стерильними. Стерильні мензурки, циліндри і стакани закривають кришками.

Розріджувач готують за 2 – 3 год. до взяття і розбавлення сперми. При розбавленні сперма і розріджувач повинні мати однакову температуру (35 – 40º С). Спермоприймач або градуйовану колбу для розбавлення сперми і посуд з розріджувачем ставлять у теплу воду (водяну баню). Розріджувачі повільно доливають до сперми, старанно помішуючи стерильною скляною паличкою. Якщо розбавляти сперму інакше, сперматозоони можуть загинути.

Приготування: спочатку всі компоненти розріджувача повністю розчиняють у дистильованій воді. Потім додають бактеріостатичні речовини (пеніцилін, стрептоміцин, або спермосан 3) і в останню чергу – жовток курячого яйця. Чисте яйце обробляють тампоном, який зволожений 96º спиртом – ректифікатом. Шкаралупу обережно розбивають і виливають білок, а жовток розміщують у стерильну чашку Петрі або на стерильний фільтрувальний папір. Оболонку жовтка проколюють і вливають його у стерильну мензурку, або безпосередньо в розріджувач, одночасно перемішуючи скляною паличкою.

Посуд з розріджувачем закривають стерильною кришкою і тимчасово ставлять у термостат або водяну баню. Температуру в розріджувачі підтримують до 35ºС.

Використовують глюкозоцитратно – жовтковий розріджувач:

Вода дистильована 100мл

Глюкоза медична безводна 3 г

Натрію цитрат 1,4 г

Жовток курячого яйця 20 мл.

На 100 мл розріджувача добавляють бактеріостатичні речовини 75 – 100 тис. ОД пеніциліну кристалічного (натрієва або калієва сіль), 75 – 100 тис. ОД стрептоміцину (сірчано- або солянокислого). 0,12 г стрептоциду або 250 – 300 тис. ОД спермосану – 3.

Сперму барана розбавляють у 2 – 4 рази в спермоприймачі, бугая – у 20 – 40 – 50 разів у градуйованій колбі, жеребця – у 3 – 5 і кнура – у 2 – 6 разів.

Завдання № 7.

Засвоєння способів тривалого зберігання сперми в рідкому азоті.

Тривале зберігання сперми в рідкому азоті. В кінці 40-х років І.В.Смирнов вперше заморозив сперму кролів, жеребців, баранів і бугаїв. У 1950 – 1961 рр. він одержав перших телят і ягнят від корів і вівцематок, запліднених замороженою спермою. Сперму можна заморожувати у твердій вуглекислоті (-79º С), у рідкому кисню (-183º С) і в рідкому азоті (-196º С). Останнім часом широкого практичного застосування набув метод заморожування і зберігання сперми у рідкому азоті.

Перед заморожуванням сперму охолоджують до температури 2 – 5 ºС.

Заморожування сперми у формі гранул.

Сперму заморожують після її оцінки і розбавлення лактозогліцериново – жовтковим середовищем на фторопластових пластинах.

Спочатку пластини, заздалегідь знезаражені променями бактерицидних ламп, охолоджують у рідкому азоті 8 – 10 хв у спеціальних ваннах. Потім у лунки фторопластової пластини розфасовують сперму. Сперму наносять на пластину по 0,15 – 0,2 мл за допомогою градуйованої піпетки, шприца або автоматичного пристосування. Через кілька секунд після того, як в останній лунці сперма затвердіє, пластину опускають у посуд (ванну) з рідким азотом і витримують протягом 2 – 3хв. Далі пластину виймають назовні, збирають гранули за допомогою лопаточки в ємності (туби, каністри, пластмасові стаканчики чи марлеві мішечки) прикріплюють етикетку, де зазначено номер плідника, породу, дату заморожування сперми, кількістю доз тощо і переносять у посудину Дюара для карантинування.

Заморожування сперми в облицьованих гранулах.

Після оцінки і розбавлення сперму заморожують за допомогою спеціального автомата за схемою харківської технології асептичного одержання, обробки, консервації сперми.

Заморожування сперми в пайєттах.

Сперму після розбавлення і охолодження до t 22º С розфасовують у поліпропіленові соломинки в дозах по 0,25 мл після маркірування за допомогою автомата. Наповненні соломинки надходять в спеціальний пристрій машини де їх закупорюють з обох кінців, потім сперму ставлять у холодильник при постійній

t 4º С, де сперма поступово охолоджується протягом 3 – 4 год. Після цього сперма відправляється на заморожування яке проводять у стаціонарному сховищі на мідній пластині протягом 5хв. Одночасно заморожують до 750 спермодоз.

Після заморожування сперму у пайєттах збирають у пластмасові стакани і зберігають у сховищі. Розморожують сперму у водяній бані при температурі 38 - 40º С протягом 10 с.

Завдання № 8.

Розморожування сперми.

Для розморожування сперми в гранулах використовують водяну баню з температурою води 40º С, куди ставлять пеніциліновий флакон, або ампулу з 1 мл 3% розчину натрію цитрату на 2 – 3 хв. В процесі підігрівання та розморожування сперми флакони накривають стерильними скельцями. Відкривши посудину Дюара, кришку ставлять верхом донизу, щоб не потрапили мікроорганізми. Спочатку охолоджують пінцет або корнцанг до температури рідкого азоту, опустивши їх у посудину. Швидко (за 4 – 5с) підтягують стаканчик з спермою до горловини, корнцангами дістають гранулу сперми і відносять у флакон з підігрітим розчином, а стаканчики опускають у посудину з азотом, закривши її пробкою. Ампули або флакони з гранулами розморожують у водяній бані, періодично похитуючи ними протягом 8 – 10 с і швидко виймають. Перевіряють її на активність під мікроскопом при збільшенні у 200 разів і температурі 40º С. Активність сперми повинна бути не менш як 4 бали.

Гранули об’ємом 0,5 – 1 мл розморожують без додавання розчину натрію цитрату. Флакони вміщують у водяну баню, підігрівають воду до температури 38 - 40ºС, витримують 2 – 3 хв. Потім у флакон вносять 2 гранули замороженої сперми і витримують у водяній бані до переходу їх у рідку фазу. Флакон із спермою виймають з водяної бані і досліджують.

Після виконання роботи студенти повинні:

знати: методи оцінки сперми, техніку визначення різних методів і способів оцінки сперми; інструменти, що застосовують для визначення якості сперми.

вміти: готувати інструменти до роботи, проводити оцінку якості сперми описаними методами, зіставляти дані оцінки з наведеними в таблиці показниками.

Завдання додому: Повторити матеріал і підготуватися до заліку. 1 Карташов І.І Шарапа. Г.С. Акушерство гінекологія і штучне осіменіння сільськогосподарських тварин. – К.: Вища школа 1991. с.45 – 65.

Інструктивна картка

для проведення практичного заняття № 4

з дисципліни "Акушерство та гінекологія

сільськогосподарських тварин"

Тема: Ознайомлення з роботою, обладнанням, устаткуванням і документацією одного з пунктів штучного осіменіння і відповідність його ветеринарно - санітарним вимогам.

Місце заняття: пункт або станція по штучному осіменінні тварин. Тривалість заняття: 6 год.

Мета: Ознайомитись з роботою, обладнанням та документацією лабораторії по штучному осіменінні, способами підготовки та знезаражування розчинів інстументів та матеріалів які використовуються при штучному осіменні тварин.

Матеріально - технічне оснащення: вода дистильована та водопровідна гаряча, спирт, дезрозчини, розчин цитрату натрію, хлориду натрію, марля, вата, ватні тампони, скляні палички, лійки колби, мензурки, циліндри, баночки з притертими кришками, ножиці, піпетки, корнцанги, піхвові дзеркала, шпателі, спермоприймачі, шпци — катетери, одноразові інструменти для різних способів осіменіння, поліетиленові рукавиці, каструля емальована чи стерилізатор, електро- чи газова плитка, дистилятор, сушильна шафа чи автоклав, рушники, мило.