Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Вирусоскопический метод – заключается в обнаружении вируса в исследуемом материале при помощи: световой микроскопии (с обязательным использованием специальных методов окраски, использованием протрав и импрегнации), электронной микроскопии, люминесцентной микроскопии.

Вирусологический метод – заключается в заражении исследуемым материалом чувствительной биологической модели (лаб. животное, куриный эмбрион, культура клеток, тканей, органов), индикации вируса и его последующей идентификации.

Серологический метод – применяется для выявления вирусного антигена или обнаружения специфических антител в исследуемой сыворотке. Особенность этого метода – исследование парных сывороток. Первую сыворотку берут у больного в острый период в начале болезни, хранят при t = 4-8ºC, а вторую – через 10-14 дней. Сыворотки исследуют одномоментно! О болезни свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по сравнению с первой (диагностическое значение имеет сероконверсия в 4 раза и выше.)

Экспресс-диагностика – использование чувствительных и надежных иммунологических методов (иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг, вестерн-блотт и др.).

Методы культивирования вирусов

Для культивирования вирусов в лабораторных условиях используются следующие биологические модели: 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные животные.

I. Культуры клеток.

В зависимости от техники приготовления культуры клеток классифицируют на:

- однослойные – клетки способны прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла или пластика.

- суспензионные – клетки размножаются во всем объеме питательной среды при ее перемешивании.

- органные - цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применение ограничено).

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить в зависимости от числа жизнеспособных генераций на

1) первичные (первично трипсинизированные),

2) полуперевиваемые (диплоидные)

3) перевиваемые.

По происхождению они классифицируются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов.

По морфогенезу - на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток - это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (или диплоидные) культуры клеток - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин. Чаще всего используют культуры фибробластов эмбриона человека (WI-38, MRC-5, IMR-9), коров, свиней, овец и т.д.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ – сердце обезьяны цинамобус, ПЭС – почки эмбриона свиньи, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки, Vero – почка зеленой обезьяны и др.) отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными. Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Нер-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH - из почки человека, КВ – карцинома ротовой полости, RD – рабдомиосаркома человека.

Культуры органов – представляют собой приготовленные в стерильных условиях срезы органов животных, которые на протяжении определенного срока (дни, недели) сохраняют свою жизнедеятельность в особенных условиях культивирования

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие.

В составе ростовых питательных сред должно содержаться большое количество питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя.

Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Они могут быть:

1) природными (сыворотка крови крупного рогатого скота, жидкости из серозных полостей, продукты гидролиза молока, различные гидролизаты – гемогидролизат, гидролизат лактальбумина, экстракты тканей)

2) синтетическими (среда 199 для культивирования первично-трипсинизированных и перевиваемых культур, среда Игла – содержит минимальный набор аминокислот и витаминов и используется для культивирования различнах линий клеток, среда Игла МЕМ – культивирование особо требовательных линий клеток).

Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса.