Задание 6. Количественное определение концентрации белка по методу Лоури

Принцип метода: В основе этого метода, как и метода с биуретовым реактивом, лежит способность ионов двухвалентной меди образовывать окрашенный комплекс с химическими группами пептидных связей. Применение реактива Фолина-Чокальтеу (кислый фосфорно-молибденово-фосфорновольфрамовый реактив) позволило повысить чувствительность метода благодаря взаимодействию реактива с остатками ароматических аминокислот. Белки с реактивом Фолина-Чокальтеу в присутствии сернокислой меди и щелочи дают комплексное соединение синего цвета. По интенсивности окраски судят о концентрации белка. Метод характеризуется высокой чувствительностью (10-100 мкг белка в пробе).

Ход работы: Определение концентрации белка проводят, используя калибровочную кривую, построенную для стандартного белка (бычий сывороточный альбумин), как и в биуретовом методе.

1. Производят разведение стандартного белкового раствора с концентрацией 0,25 мг/мл следующим образом:

№ пробы	Объем раствора белка, мл	Объем дист. воды, мл	Концентрация белка, мг/мл	Содержание белка в пробе, мг	Ед. погло-щения (OD)
1	–	0,4	-	–
2	0,1	0,3	0,063	0,025
3	0,2	0,2	0,125	0,050
4	0,25	0,15	0,155	0,063
5	0,3	0,1	0,188	0,075
6	0,4	–	0,250	0,100
7(задача)	0,4	–	?	?

Проба №1 содержит вместо белка воду и является контрольной. Объем всех исследуемых проб должен быть одинаковым и составлять в данном случае 0,4 мл.

2. Ко всем пробам прибавляют по 2 мл реактива С, щелочного раствора, содержащего медь. Оставляют пробы при комнатной температуре.

3. Через 10 мин в каждую пробу приливают по 0,2 мл реактива Е (реактив Фолина-Чокальтеу), хорошо перемешивают и оставляют на 40 мин для развития окраски.

4. После этого в каждую пробу прибавляют по 2,5 мл воды и фотометрируют на фотоэлектроколориметре при длине волны 660 нм. Фотометрирование проводят против фотометрического контроля, которым является проба №1.

5. Показания прибора заносят в таблицу затем строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат значения оптической плотности, а по оси абсцисс - концентрацию (или содержание) белка.

6. Содержание белка в задаче рассчитывают по калибровочной кривой.

Примечание: К недостаткам метода следует отнести то, что на развитие окраски влияет большое количество веществ: буферные системы (трис-буфер, глицилглицин), восстановители (цистеин, дитиотреитол, аскорбиновая кислота), детергенты, сахароза и др. В связи с этим при построении калибровочного графика в растворитель для стандартного белка необходимо включать все компоненты, кроме белка, которые содержатся в анализируемых пробах.