Задание 5. Количественное определение концентрации белка биуретовым методом
Принцип метода: Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белков с ионами двухвалентной меди. Существуют 2 разновидности метода: при одной из них определяют от 2 до 10 мг белка в пробе; при другой (микрометод) - от 0,1 до 2 мг. Для протекания этой реакции необходимо наличие, по крайней мере, двух пептидных связей:
Комплексное соединение, образующееся в результате взаимодействия белков с биуретовым реактивом
Колориметрический анализ проводят сравнением поглощения света исследуемым раствором с поглощением проб стандартного ряда (калибровочная кривая). В качестве стандарта часто используют раствор бычьего сывороточного альбумина в воде или буферном растворе.
Ход работы:
Производят разбавление стандартного белкового раствора с концентрацией 2 мг/мл следующим образом:
№ пробы |
Объем раствора белка, мл |
Объем дист. воды, мл |
Концентрация белка, мг/мл |
Содержание белка в пробе, мг |
Ед. погло-щения (OD) |
1 |
– |
3,0 |
– |
– |
|
2 |
0,3 |
2,7 |
0,2 |
0,6 |
|
3 |
0,6 |
2,4 |
0,4 |
1,2 |
|
4 |
0,9 |
2,1 |
0,6 |
1,8 |
|
5 |
1,5 |
1,5 |
1,0 |
3,0 |
|
6 |
2,0 |
1,0 |
1,32 |
4,0 |
|
7 |
3,0 |
– |
2,0 |
6,0 |
|
8(задача) |
3,0 |
– |
? |
? |
|
Проба №1 содержит вместо белка воду и называется контрольной. Объем всех исследуемых проб должен быть одинаковым и в данном случае составляет 3 мл.
Во все пробы добавляют по 2 мл биуретового реактива, тщательно перемешивают и выдерживают 30 мин при комнатной температуре.
После этого пробы фотометрируют на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм (500-560 нм, зеленый светофильтр) против фотометрического контроля, которым является проба №1. Показания прибора (оптическая плотность, OD, А) заносят в таблицу и затем строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат значения оптической плотности, а по оси абсцисс - концентрацию (или содержание) белка. Калибровочный график должен иметь вид прямой, выходящей из начала координат.
Параллельно с пробами для калибровочной кривой ставятся и опытные пробы *. Объем исследуемого белка (опытной пробы) – 3 мл.
* Необходимо помнить, что интенсивность окраски определяется концентрацией вещества, но зависит также от температуры и времени развития окраски. Поэтому опытные и стандартные пробы должны быть обработаны в строго определенных одинаковых условиях.
Расчеты концентрации белка в опытных пробах проводят, пользуясь калибровочным графиком. Если оптическая плотность пробы выходит за его пределы, необходимо заново приготовить образец белка таким образом, чтобы попасть на калибровочную кривую.